[发明专利]一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法，所述食品级嗜热链球菌表达系统包含食品级宿主嗜热链球菌CH3080、食品级表达载体pST4040；所述食品级宿主嗜热链球菌CH3080是采用同源重组技术敲除嗜热链球菌基因组上的β‑半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因而获得，丧失利用乳糖的能力；食品级表达载体pST4040包含来自于嗜热链球菌的β‑半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因作为互补筛选标记；所述表达系统为食品级表达系统，其DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记，可以直接应用于食品医药等行业中。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法。

背景技术

乳酸菌是能够发酵糖类产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的通称，广泛存在于乳制品，泡菜以及肠道环境中。作为公认的安全级微生物，许多性状优良的菌株已被用于食品发酵行业中。近年来，乳酸菌的基因工程操作在食品安全以及改良食品的开发和健康方面具有广阔的应用前景。其中，食品级表达载体是一种常用的基因工程操作工具。食品级表达载体应具有稳定的、显性的、易于识别的选择标记。对于正在开发的食品级选择标记有显性标记和互补标记两大类。显性标记通常是利用宿主菌的特性，例如细菌素抗性、镉抗性、热敏等以取代抗生素抗性标记，以达到筛选的目的。而互补标记需要开发具有特定缺陷的宿主菌株，再其由标志物补充以恢复原始表型，例如无义抑制基因supD、胸苷酸合成酶基因thyA和丙氨酸消旋酶alr基因。互补系统在培养基中不需要任何其他补充。与显性标记相比，它们不受培养条件的限制。

目前已报道的嗜热链球菌食品级载体选择标记是胸苷酸合成酶基因thyA。胸苷酸合成酶在DNA的合成中起关键作用，缺失胸苷酸合成酶基因的菌株在基本培养基中不能生长。Sasaki等构建了以thyA基因为选择标记的食品级表达载体，用外源的α-淀粉酶(amyA)基因在营养缺陷型的嗜热链球菌自发突变体TM1-1中测试了其表达能力，开发了一种用于嗜热链球菌的安全食品级表达系统。但是这种系统的应用需要配制包含胸苷酸的特定培养基，增加了使用成本。

中国文献《β-半乳糖苷酶基因及其在基因学中的应用》(汪川，《预防医学情报杂志》，2002年第18卷第3期)公开了通过众多学者的努力，β-半乳糖苷酶基因库已基本建立并将日趋完善。中国文献《β-半乳糖苷酶的研究现状与进展》(董艺凝，陈海琴，张灏等，《食品与生物技术学报，2018年第37卷第4期》)公开了对于β-半乳糖苷酶的家族分布及其催化机制的形成特点目前尚无系统的分析与总结。

不同来源的β-半乳糖苷酶在酶学特征上存在较大的差异，目前，关于利用大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶基因构建载体的研究报道较多，但是，关于利用其他细菌中的β-半乳糖苷酶基因构建表达载体的研究报道较少，尤其是构建食品级表达系统的研究报道更少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法，该套嗜热链球菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有的DNA原件来自于公认的安全的微生物，不含有抗生素筛选标记。

本发明的技术方案如下：

一株食品级宿主嗜热链球菌CH3080的构建，包括如下步骤：

(1)提取嗜热链球菌JIM8232(Streptococcus thermophilus JIM8232)的基因组DNA；

(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂；