[发明专利]一种基于超速PCR与功能核酸显色的定量检测方法

说明书

本发明提供一种基于超速PCR与功能核酸的定量检测方法，采用优化的超速PCR反应体系进行检测，比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使长度为600bp‑2000bp或更长的DNA长靶标片段检测成为可能，便于携带和野外作业，在包括食品安全和快速检测领域的微生物检测领域，具有非常好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种致病菌长靶标序列的快速比色传感新方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)作为一种用于放大扩增特定的DNA靶标片段的分子生物学技术，广泛应用于食品安全、环境监测与临床诊断领域。随着检测时效性需求的增加，超速PCR技术应运而生，将数小时的PCR扩增时间减少至数分钟。然而，受制于PCR反应动力学因素，超速PCR技术仅用于扩增较短的靶标序列，对于待测DNA长度较长的靶标无法扩增。

另外，对于扩增产物的检测，传统的凝胶电泳方法，耗时长、易形成气溶胶污染，电泳所用的化学品对人体危害较大；而实时荧光检测中使用DNA双链荧光嵌入剂，如SYTO9、SYBRGreenI、GelRed等，通过计算Ct值的大小间接表征核酸扩增情况。上述方法均成本较高，耗时长，不利于便捷化使用，其结果不可视，不容易分析。

本课题组为了解决极速PCR检测的便捷化应用问题，提供了一种超速PCR可视化检测方法(Visual single cell detection of dual-pathogens based on multiplexsuper PCR (MS-PCR) and asymmetric tailing HCR (AT-HCR), 《Sensors andActuators B: Chemical》Volume 260, Pages 870-876)，具体为：设计特异性上游引物，并在上游引物的5’末端加入修饰有oxyethyleneglycol化学修饰、且能够发生自身互补的接头序列(AGAGAGAGAGAGGGAAAGAGAGAG-oxyethyleneglycol-CTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCTC)与间隔序列(TTTTTT)。在超速PCR扩增靶标序列的同时，利用oxyethyleneglycol化学修饰阻断ExTaq DNA聚合酶延伸，使PCR扩增子携带有单链DNA突出末端；而该单链DNA突出末端作为杂交链式反应的激发序列，启动了自组装反应，形成了大量带有3’端突出粘性末端的DNA双链结构；进一步，大量存在的3’端突出粘性末端作为末端脱氧核酸转移酶的催化位点，形成富含鸟嘌呤G的单链DNA，在氯高铁血红素的诱导下，由末端脱氧核酸转移酶催化形成富G单链组装形成G-四联体，发挥辣根过氧化物酶活性，完成显色。即采用“超速PCR扩增-杂交链式反应-末端脱氧核酸转移酶-G-四联体显色”的4个环节完成超速PCR并显色。

但上述技术仍有可以改进之处。

发明内容

定义：

本发明中的“超速PCR”指通过两个温控体系完成一个循环，进而完成PCR的扩增，区别于常规PCR中由退火、复性、延伸三步骤完成一个循环的PCR扩增方法，同时在常规意义理解上超速PCR用时要短于普通PCR方法。

本发明中的“G-多联体”指被胡斯特氢键稳定的、能够形成富含鸟嘌呤的多层构象的功能核酸高级构象。“G-多联体”可以是G-二联体、G-三联体、G-四联体，还可以是5'-GGTTGGTGTGG-3'。本发明中的“G-多联体”以及“G-二联体”、“G-三联体”、“G-四联体”均指能够与氯高铁血红素（hemin）结合发生显色反应的由氢键稳定、富含鸟嘌呤的多层构象功能核酸。

G-二联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-Z；

Y表示0-2个核苷酸残基，α表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。