[发明专利]基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法

权利要求书

1.基于双色荧光分析法的定量检测氯霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将标记有荧光基团ROX的氯霉素核酸适配体和标记有猝灭基团BHQ-2并与所述氯霉素核酸适配体互补的寡核苷酸分别溶于Tris-HCl缓冲溶液中，配制浓度均为120nmol/L的反应液A和B；

2)将氯霉素溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，配制浓度为0.28、0.56、1.12、2.24、4.48、6.72、8.96、11.20、14.00nmol/L的氯霉素标准液，为反应液C；

3)将10000×SYBR Green I核酸染料二氯亚砜浓缩原液用Tris-HCl缓冲溶液稀释10000倍，配制为反应液D；

4)取反应液A、C各50μL混合均匀，加热使其完全反应，然后加入B、D各50μL，补充Tris-HCl缓冲溶液至总体积为500μL，室温下反应；

5)待步骤4)中的反应完成后，将500μL混合液转移至微量比色皿中，分别进行同步荧光分析，同步扫描的固定波长差设置为28nm、激发起始波长设置为372nm，并在400-700nm范围内进行同步荧光扫描；获得荧光基团ROX及SYBR Green I核酸染料的同步荧光扫描光谱图，分别得到它们最大发射波长处的荧光强度；

6)在氯霉素浓度为0.28nmol/L～14nmol/L的范围内，拟合体系荧光强度与氯霉素浓度的之间的回归方程：以SYBR Green I核酸染料和荧光基团ROX在最大发射波长处的荧光强度变化值与氯霉素浓度之间拟合的回归方程分别为ΔF₁＝42.307C+0.244和ΔF₂＝59.967C+4.459；以SYBR Green I的荧光强度变化值与荧光基团ROX的荧光强度变化值之和为纵坐标，其对应的氯霉素浓度为横坐标，得到荧光强度与氯霉素浓度之间的回归方程ΔF₃＝102.275C+4.703；其中，ΔF₁与ΔF₂分别为加入氯霉素后和加入氯霉素前传感器中SYBRGreen I的荧光强度变化值和荧光基团ROX的荧光强度变化值，ΔF₃为加入氯霉素后和加入氯霉素前传感器中SYBR Green I的荧光强度变化值与荧光基团ROX的荧光强度变化值之和，C为氯霉素的浓度，单位为nmol/L；

7)对实际样品的测定：将实际样品中的氯霉素提取后，将浓度调整到步骤6)所述的范围内，然后按步骤4)和5)进行操作，结合步骤6)中所得到的回归方程ΔF₃＝102.275C+4.703，计算实际样品中氯霉素的浓度，以实现对实际样品中氯霉素的定量检测。

2.根据权利要求1所述的定量检测氯霉素的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl缓冲溶液为0.2mol/L的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的定量检测氯霉素的方法，其特征在于，步骤4)中，加热的温度为37℃、时间为30min、pH值为7.7，室温下反应的反应时间为10min。

4.一种实现权利要求1-3中任一项所述的方法的试剂盒。

5.一种基于双色荧光分析法的定量检测氯霉素的试剂盒，包括标记荧光基团的氯霉素核酸适配体，标记猝灭基团并与所述的氯霉素核酸适配体互补的寡核苷酸，SYBR Green I核酸染料，氯霉素标准品以及Tris-HCl缓冲液；其特征在于，所述荧光基团为ROX，所述猝灭基团为BHQ-2；

所述的氯霉素核酸适配体和与其互补的寡核苷酸形成双链DNA，SYBR Green I核酸染料与所述双链DNA结合后，荧光强度会显著增强；当氯霉素不存在时，连有荧光基团的氯霉素适配体与连有猝灭基团的寡核苷酸形成的双链DNA，连接在氯霉素适配体一端的荧光基团与连接在寡核苷酸一端的猝灭基团相互靠近，发生荧光共振能量转移，荧光基团的荧光被猝灭基团猝灭，荧光基团的荧光信号很弱；与此同时，核酸染料SYBR Green I与双链DNA作用，荧光信号增强；当氯霉素存在时，连有荧光基团的氯霉素适配体与氯霉素结合形成特异性空间结构，导致连有荧光基团的氯霉素适配体不能再与连有猝灭基团的寡核苷酸形成双链DNA，荧光基团的荧光不能被猝灭基团猝灭，荧光基团的荧光信号恢复，另外，由于没有形成双链DNA，核酸染料SYBR Green I不能与单链DNA作用，其荧光信号很弱；

通过荧光基团在其最大发射波长处荧光增强的程度和核酸染料SYBR Green I在其最发射波长处荧光减弱的程度之和，即通过荧光基团在其最大发射波长处荧光强度变化值和核酸染料SYBR Green I在其最大发射波长处荧光强度变化值之和，实现对氯霉素的双色荧光定量检测，其中，荧光基团的最大发射波长为613nm，核酸染料SYBR Green I的最大发射波长为524nm。