[发明专利]基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于双色荧光分析法定量检测氯霉素的试剂盒及方法，所述的试剂盒包括标记荧光基团的氯霉素核酸适配体A、标记猝灭基团并与A互补的寡核苷酸B以及SYBR Green I核酸染料，根据SYBR Green I荧光减弱的程度和荧光基团的荧光增强程度可实现对氯霉素的高灵敏定量检测。与现有技术中单独使用某一种荧光染料相比，本发明利用两种染料荧光强度变化之和对氯霉素进行检测，能显著地提高氯霉素检测的灵敏度，降低检出限，适合低浓度的痕量检测。

技术领域

本发明属于化学传感器及分析技术领域，具体涉及一种基于双色荧光分析法高灵敏定量检测氯霉素的试剂盒及方法。

背景技术

抗生素类药物自研发以来就在医药领域和很多的养殖业中广泛应用，但抗生素大量无节制的使用，随之而来的就是大量含超标药物的废水排放，造成水体的污染。以氯霉素(CAP)为例，CAP具有良好的杀菌消炎作用，并且广普适用、价格便宜，在生产和生活中被大量使用。排放的含CAP废水隶属于有机废水，自然状态下难以降解，且容易被水生生物富集，然后通过食物链传递回到人体，最终对人体造成伤害。长期食用含有CAP的食物将引起机体免疫力下降，身体对病原体的抗性降低，使得部分致病菌产生抗药疾病难以治愈，严重时会导致肝肾损伤。

现有的对于CAP的定性定量检测方法，检测过程过于繁琐，费时费力，成本也相对较高。荧光检测方法因其高的灵敏度而被广泛地应用于目标物的检测中。赵秋伶和张振宇(参见文献《无标记型核酸适体荧光传感器检测氯霉素的含量》)结合无标记CAP核酸适配体及核酸染料SYBR GreenI，建立了一种简单的CAP荧光定量检测法。这种方法操作简单、检测时间短、检测成本低，而且由于引入了CAP的核酸适配体，所以方法的选择性非常好。但是这种方法具有两个明显的不足：一是只用了一种核酸染料SYBR GreenI作为荧光响应信号，其灵敏度相对较低；二是由于灵敏度不高，线性范围不宽，方法检出限相对较高(6μmol/L)，不适合低浓度的痕量检测。

本发明在此基础上进行了改进，在两条互补单链DNA上分别连接有荧光基团和猝灭基团，再结合核酸染料SYBR Green I实现对氯霉素的双色荧光定量检测。对氯霉素的双色荧光定量检测的原理如图1所示。SYBR Green I本身的荧光信号很弱，与单链DNA也几乎不发生作用，但它与双链DNA有很强的亲和性，且与双链DNA结合后，其荧光强度会显著增强。在没有氯霉素时，连有荧光基团的氯霉素适配体与连有猝灭基团的互补短链DNA杂交形成双链，连接在氯霉素适配体一端的荧光基团与连接在互补短链DNA一端的猝灭基团相互靠近，发生荧光共振能量转移，荧光基团的荧光被猝灭基团猝灭，荧光基团的荧光信号很弱；与此同时，核酸染料SYBR Green I与杂交反应形成的双链DNA作用，荧光信号很强。当氯霉素存在时，连有荧光基团的氯霉素适配体与氯霉素结合形成一定的空间结构，导致其不能再与连有猝灭基团的互补短链DNA杂交形成双链，荧光基团的荧光不能被猝灭基团猝灭，其荧光信号恢复；另外，由于没有双链DNA，核酸染料SYBR Green I又不能与单链DNA作用，其荧光信号很弱。这样，通荧光基团荧光增强和核酸染料SYBR Green I减弱的程度，即可实现对氯霉素的双色荧光定量检测。

基于上述研究背景，本发明基于核酸荧光适配体和SYBR Green I核酸染料，开发了一种高灵敏度、高选择性的CAP的双色荧光定量检测方法，实现较低成本并且快速检测氯霉素药物的目的。在本发明中，我们利用两种染料荧光强度变化之和对目标进行检测，与单独使用某一种荧光染料相比，能显著地提高氯霉素检测的灵敏度(标准曲线的斜率显著增大)；另外，与单独使用某一种荧光染料相比，由于检测灵敏度的提高，方法的线性范围也显著增加，且检出限显著降低。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于双色荧光法高灵敏定量检测氯霉素的试剂盒及方法，利用两条分别标记有荧光基团和猝灭基团的DNA以及核酸染料SYBR Green I共同构成了一个氯霉素的检测传感器，从而实现对CAP的高灵敏及高选择检测。该方法降低了原有的检测方法的检出限，检测过程方便快捷，所需反应时间短，并且在不同抗生素存在的条件下仍可实现高灵敏、高选择性的检测。