[发明专利]一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法

权利要求书

1.一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法，其特征在于：包括如下实验步骤：

步骤一、细胞培养和缺氧模型建立；

步骤二、外泌体的分离；

步骤三、外泌体鉴定；

步骤四、建立小鼠脊髓损伤模型；

步骤五、RNA测序；

步骤六、小鼠运动功能评分；

步骤七、实时定量PCR分析；

步骤八、免疫荧光评估；

步骤九、蛋白质印迹分析；

步骤十、质粒构建和转染；

步骤十一、BV2小胶质细胞摄取外泌体；

步骤十二、酶联免疫吸附测定；

步骤十三、双重荧光素酶报告基因检测；

步骤十四、统计分析。

2.如权利要求1所述的外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法，其特征在于：包括如下实验材料：野生型C57BL/6小鼠和基因敲除C57BL/6小鼠。

3.如权利要求1所述的外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法，其特征在于：包括如下试剂配置：PBS溶液、10％SDS、1.0MTris-HCl、30％储备溶胶、10％AP、10×电泳缓冲液、封闭液、10×转膜缓冲液、1×TBST缓冲液和4％多聚甲醛。

4.如权利要求1所述的外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法，其特征在于：细胞培养和缺氧模型建立具体包括如下步骤：

S1、脂肪干细胞提取培养，具体操作如下：

(1)做好实验前准备，包括实验用品消毒，紫外线消毒，手部清洁等；

(2)取3只野生型C57BL/6小鼠，麻醉成功后，取仰卧位固定在手术台上，切开小鼠腹股沟区皮肤约2cm，取皮下脂肪组织，缝合双侧伤口，将脂肪组织放入PBS溶液内洗净；

(3)将洗净的脂肪组织放入玻璃烧杯中，加入0.075％Ⅱ型胶原酶，用量200U/ml，置于37℃恒温箱中30分钟，每隔5-10min振荡一次，30min后，生理盐水终止胶原酶的消化；

(4)将混合液放入离心管内，以1200g,1200r/min离心10分钟，去除上清液及未消化的脂肪，使用10％FBS的DMEM重悬细胞沉淀，使用0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经铜网过滤，1200r/min离心10分钟，加入培养液吹打混匀后取样计数，根据计数结果调整细胞浓度为104个细胞/ml；

(5)接种培养：每10cm2的培养瓶接种1ml细胞悬液金额4ml培养液，置于37℃、5％CO2恒温箱培养；

(6)选用第3-5代的ADSC用于下一步的实验；

S2、细胞缺氧缺糖模型建立，具体操作如下：

(1)取培养一周生长成熟的神经元细胞,按1×106个/mL的密度接种于多孔板；

(2)将原培养液吸出,用PBS洗涤三次,加入含有相应浓度药物的无糖培养基；

(3)将培养皿放置于缺氧装置中,通入95％氮气和5％二氧化碳的混合气体,充满装置后,封口膜密封,放入37℃恒温箱孵育3-6小时；

(4)将培养皿取出，进行下一步实验；

S3、BV2小胶质细胞系在含有10％FBS和1％pen/strep的DMEM/高葡萄糖培养基中培养。将LPS与BV2小胶质细胞共培养24h，然后在不同组的培养基中添加外泌体。