[发明专利]一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法

说明书

本发明涉及医学实验技术领域，具体为一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法，包括如下实验步骤：步骤一、细胞培养和缺氧模型建立；步骤二、外泌体的分离；步骤三、外泌体鉴定；步骤四、建立小鼠脊髓损伤模型；步骤五、RNA测序；步骤六、小鼠运动功能评分；步骤七、实时定量PCR分析；步骤八、免疫荧光评估；步骤九、蛋白质印迹分析；步骤十、质粒构建和转染；步骤十一、BV2小胶质细胞摄取外泌体；步骤十二、酶联免疫吸附测定；步骤十三、双重荧光素酶报告基因检测；步骤十四、统计分析，本发明提供的实验方法很直观的证明了含有lncGm37494的ADSCs处理的外显子通过转移小胶质细胞M1/M2极化可更有效地修复脊髓损伤。

技术领域

本发明涉及医学实验技术领域，具体为一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法。

背景技术

间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。临床上，间充质干细胞已被用作患者创伤或化疗之后血细胞的快速恢复。当患者接受大剂量化疗后，血细胞损失严重，医生将间充质干细胞与造血干细胞一同输入患者体内，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。越来越多的证据表明，间充质干细胞(MSC)移植可能是治疗SCI的有效疗法。具体而言，已有研究表明该疗法可通过将神经小胶质M1转变为M2极化来促进感觉和功能恢复，并降低促炎因子水平，但是，当将MSC直接移植到目标组织中时，局限性和挑战不容忽视。研究报道，移植的干细胞存活率很低。缺氧预处理或抗应激分子转染可使干细胞增强治疗效果。深入的研究发现，MSC在组织再生中的作用表明，旁分泌机制可能参与了多种疾病的治疗中潜在的MSC作用机制，而外泌体可能在此过程中发挥重要作用。外泌体(Exos)是膜状脂质囊泡(直径为40-100nm)，包含功能蛋白，mRNA，长非编码RNA(lncRNA)，microRNA和物质，并参与细胞之间的信息传递过程。先前的研究发现，来自骨间充质干细胞的外泌体通过抑制补体mRNA的合成和释放以及通过与小胶质细胞结合而抑制SCI激活的NF-κB在脊髓损伤中起保护作用。研究发现，MSC外泌体可以通过改变神经源性疾病中的小胶质细胞/巨噬细胞表型来抑制炎症的发展。但是，具体的分子机制仍需要进一步确定，研究发现缺氧预处理ADSCs使Exos中lncGm37494含量增加。lncGm37494修饰ADSCs处理的外显子通过转移小胶质细胞M1/M2极化来更有效地修复脊髓损伤，但目前还没有一种行之有效的实验方法来对上述结论进行有力的论证。鉴于此，我们提出一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法。

发明内容

为了弥补以上不足，本发明提供了一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法。

本发明的技术方案是：

一种外泌体诱导小胶质细胞极化修复脊髓的实验方法，包括如下实验步骤：

步骤一、细胞培养和缺氧模型建立；

步骤二、外泌体的分离；

步骤三、外泌体鉴定；

步骤四、建立小鼠脊髓损伤模型；

步骤五、RNA测序；

步骤六、小鼠运动功能评分；

步骤七、实时定量PCR分析；

步骤八、免疫荧光评估；

步骤九、蛋白质印迹分析；

步骤十、质粒构建和转染；

步骤十一、BV2小胶质细胞摄取外泌体；

步骤十二、酶联免疫吸附测定；

步骤十三、双重荧光素酶报告基因检测；

步骤十四、统计分析。