[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体

权利要求书

1.一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法，包括以下步骤：

利用CRISPR/Cas9系统抑制水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的接头正向引物32870-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar；所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统中，靶点gRNA表达盒的构建方法包括以下步骤：

分别以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒和pYLsgRNA-OsU6b/LacZ质粒作为模版，进行二轮的巢式PCR扩增，构建含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA；

第一轮包括两个独立的扩增反应：用引物对U-F/接头反向引物进行反应1，和引物对接头正向引物/gR-R进行反应2；反应的程序均为：94℃10s，60℃15s，68℃20s，28个循环；所述接头反向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar或核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br；所述接头正向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的接头正向引物32870-Gf或核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf；

第二轮为OverlappingPCR，用特异引物扩增表达盒产物：将第一轮反应1和反应2中的PCR产物稀释10倍混合分别作为模版；使用引物对U-GAL/Pgs-GA2，扩增产物为U6a-Badh2-gRNA；使用引物对U-GA2/Pgs-GAR扩增产物为U6b-SWEET14-gRNA；反应程序均为：95℃10s，58℃15s，68℃20s，20个循环；

所述U-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述gR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述U-GAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述Pgs-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述U-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述Pgs-GAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统中，含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体的构建方法包括以下步骤：

将含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA用重组酶连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。