[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体

说明书

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体，属于水稻改良技术领域。本发明所述方法利用CRISPR/Cas9系统抑制水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明方法能够在后代中分离获得无转基因标记的，带有香味且白叶枯病抗性显著提高的突变体，为优质抗病水稻育种提供了新的种质资源和创制方法。

技术领域

本发明涉及水稻改良技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体。

背景技术

水稻(Oryzasativa L.)是世界约一半人口的主要粮食作物，随着人们生活水平的提高，人们对稻米品质的要求越来越高。稻米的香味是食味品质的重要指标，香米具有特殊的香味，广泛受到市场和消费者的亲睐。

由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻致病变种所引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产中危害最严重的细菌性病害之一，严重时可导致高达50％的产量损失。

在常规杂交育种过程中，其分离后代香味(隐性性状)纯合基因型的单株较少，按传统检测方法会使含有香味基因的优良杂合个体在选择过程中被淘汰，最终导致香味基因的丢失。随着分子标记技术的发展，一般利用分子标记辅助选择的方法开展香味和抗白叶枯病水稻品种的选育。但是多基因的聚合操作起来有一定的难度，而且在创建导入系的过程中存在不良性状的连锁累赘，需要回交多代或者扩大分离群体的规模，才有可能打破这种连锁，延长了育种周期。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体。本发明方法能够在后代中分离获得无转基因标记的，带有香味且白叶枯病抗性显著提高的突变体，为优质抗病水稻育种提供了新的种质资源和创制方法。

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法，包括以下步骤：

利用CRISPR/Cas9系统抑制水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

优选的是，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的接头正向引物32870-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar；所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br。

优选的是，所述CRISPR/Cas9系统中，靶点gRNA表达盒的构建方法包括以下步骤：

分别以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒和pYLsgRNA-OsU6b/LacZ质粒作为模版，进行二轮的巢式PCR扩增，构建含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA；