[发明专利]一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、生产方法和应用

说明书

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、生产方法和应用。本发明利用改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶在宿主细胞中的分泌表达，提高耐热甘露聚糖酶的分泌表达量，提供了相应的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、耐热甘露聚糖酶生产方法和基因工程菌的应用。

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、生产方法和应用。

背景技术

甘露聚糖是一类半纤维素多糖，是自然界中半纤维素的第二大组分，广泛存在于植物细胞壁及一些豆科植物种籽中。然而，存在于植物细胞壁或种籽中的甘露聚糖遇水后极易膨胀，黏度大幅提高，水解困难，难以被动物和人体直接利用，因此会对这些物质的开发和利用造成非常不利的影响。

β-甘露聚糖酶是甘露聚糖降解过程中的关键酶，主要催化水解甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露糖甘键，通过与β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和α-半乳糖苷酶的协同作用可完全水解线性甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖等，因此，利用甘露聚糖酶有效降解处理甘露聚糖，可对含甘露聚糖的物质的利用产生重要作用，因而使得β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等领域均有广泛的应用前景。

传统微生物发酵产β-甘露聚糖酶往往受初始酶活低、菌株生物安全性无保障等限制，难以大规模工业化生产。随着基因工程和蛋白质工程技术的广泛运用，甘露聚糖酶的生产开始转向异源表达方面，不同来源的β-甘露聚糖酶已在多个表达宿主中成功进行异源表达，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等。然而随着β-甘露聚糖酶的应用越来越广泛，β-甘露聚糖酶的产量有待进一步提高，因此提高β-甘露聚糖酶的表达量满足工业化生产需求，降低工业化生产成本具有重要意义。

发明内容

本发明利用改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶在宿主细胞中的分泌表达，提高耐热甘露聚糖酶的分泌表达量，提供了相应的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、耐热甘露聚糖酶生产方法和基因工程菌的应用。

本发明提供的技术方案为一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽，所述改造信号肽的氨基酸序列为在SEQ ID NO:1第二位和第三位氨基酸之间添加精氨酸的序列或SEQ ID NO:1倒数第一位和第二位氨基酸之间添加赖氨酸的氨基酸序列。

而且，所述改造信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或所述改造信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

而且，所述耐热甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如GeneBank Accession No.KJ806637所示。

一种含有改造信号肽的重组质粒，所述含有改造信号肽的重组质粒是通过将改造信号肽的编码基因替换表达载体中信号肽基因获得。

而且，所述表达载体为pPIC9K、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC中的任一种。

一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的重组质粒，所述引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的重组质粒是通过将耐热甘露聚糖酶核苷酸序列插入到含有改造信号肽的重组质粒多克隆位点处获得。

一种产耐热甘露聚糖酶的基因工程菌，所述基因工程菌是通过将引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的重组质粒转化至酵母宿主细胞获得。

而且，所述宿主细胞为Pichia pastoris SMD1168、Pichia pastoris GS115、Pichia pastoris X-33、Pichia pastoris KM71中的任一种。

而且，利用产耐热甘露聚糖酶的基因工程菌在28-30℃条件下发酵5-7天获得。