[发明专利]大豆根瘤菌菌株5873PCR鉴定方法、其所用的引物及应用

权利要求书

1.大豆根瘤菌菌株5873 PCR鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)、以引物4-4进行PCR扩增；所述引物序列为：

4-4-F：5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′，

4-4-R：5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′；

PCR扩增的模板选自以下3种模板中的一种：

(a)、待测菌株的基因组DNA，其中DNA浓度为7.5ng/μL以上；或

(b)、待测菌株的纯培养菌体，加入裂解液后，经过5min沸水浴，再进行冻融后的液体，其中菌液的浓度为10⁸CFU/mL以上；或

(c)、根瘤破碎提取液，加入裂解液后，经过5min沸水浴，再进行冻融后的液体：

所述PCR的条件和体系为：Premix Taq^TM 12.5μL，引物各1.0μL，模板2μL，加ddH₂O补足至25μL；反应条件为95℃预热5min，94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，再72℃延伸10min；

(2)、对步骤(1)的PCR产物进行电泳，无355bp左右条带时，该待测菌株不是大豆根瘤菌菌株5873；有355bp左右条带时，对该待测菌株继续用引物Q1进行PCR扩增，所述引物序列为：

Q1F：5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′，

Q1R：5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′；

所述PCR的条件和体系为：Premix Taq^TM 12.5μL，引物各1.0μL，模板2μL，加ddH₂O补足至25μL；反应条件为95℃预热5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，再72℃延伸10min；

(3)、对步骤(2)的产物进行电泳，有218bp左右条带时，该待测菌株为大豆根瘤菌菌株5873；无218bp左右条带时，该待测菌株不是大豆根瘤菌菌株5873。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中待测菌株的基因组DNA是利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

3.权利要求1或2所述的鉴定方法中所用的引物，其特征在于，所述引物为4-4和Q1，引物序列为：

4-4-F：5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′

4-4-R：5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′

Q1F：5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′

Q1R：5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′。

4.权利要求1所述的大豆根瘤菌菌株5873PCR鉴定方法在大田中测定占瘤率的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为：将大豆根瘤菌5873菌液拌种到大豆种子表面，阴干后播种，待大豆生长到花期，随机选取若干个根瘤按照权利要求1进行PCR扩增，将产物电泳后统计条带，计算大豆根瘤菌菌株5873占瘤率；其中PCR扩增的模板为待测的大豆根瘤破碎后的提取液，加入裂解液后，经过5min沸水浴，再进行冻融后的液体。