[发明专利]大豆根瘤菌菌株5873PCR鉴定方法、其所用的引物及应用

说明书

本发明大豆根瘤菌菌株5873 PCR鉴定方法、其所用的引物及应用，属于菌株鉴定技术领域。所述方法包括：以待测菌株的基因组DNA或菌株的纯培养菌液或根瘤破碎提取液经裂解、沸水浴、冻融后的液体为模板，以引物4‑4进行PCR扩增；对上述PCR产物进行电泳，无355bp左右条带的不是大豆根瘤菌菌株5873；有355bp左右条带时，对该待测菌株继续用引物Q1进行PCR扩增；对上述产物进行电泳，有218bp左右条带的为大豆根瘤菌菌株5873。本发明具有以下优点：在菌株鉴定与评价方面，可以简单、快速的区分出大豆根瘤菌菌株5873，可直接用菌体或根瘤作为模板，省去了根瘤的分离、培养及DNA提取鉴定等繁琐的环节。

技术领域

本发明属于菌株鉴定技术领域，具体涉及大豆根瘤菌菌株5873 PCR鉴定方法、其所用的引物及应用。

背景技术

随着国家在农业战略上的调整，发展资源节约型、环境友好型的“两型农业”成为现代农业可持续发展的必由之路。其中，包括根瘤菌在内的微生物肥料作为绿色新型投入品和优先发展的生物制品，其不仅可修复改良土壤、减肥增效，在作物提质增效方面亦表现突出，其发展为推进‘两减一增’行动方案，实现“一控两减三基本”的目标提供了重要保障。

大豆根瘤菌作为微生物肥料产品中重要的功能菌株，可与大豆形成高效的共生固氮体系，进而有效减少化学氮肥的施用。目前，随着根瘤菌产品的增加，需要解决根瘤菌菌株的准确快速检测、菌株性能评价及其知识产权等问题。鉴于大豆根瘤菌相近的种属具有相似的菌落形态，通常我们依靠基本的生理生化反应并结合16S rRNA、atpD、glnII、recA、gyrB和rpoB基因等保守序列对菌种进行鉴定，其结果通常也只能区分到种水平，无法从菌株水平上实现生产菌株的鉴别，不利于生产菌株的知识产权保护。以慢生大豆根瘤菌为例，未见菌株水平的PCR快速检测技术，尤其是目前国内外研究和产业化应用较为常见的B.japonicum E109和B.japonicum USDA 6^T，在全基因组水平我们仅找到3个SNP位点差异，常规技术手段很难区分。此外，在应用层面上，占瘤率是评价根瘤菌接种后的结瘤能力的一个重要指标，通常借助BOX-PCR技术进行测定，该方法虽能区分到种或部分菌株水平，但过程繁琐且重复性较差。

本研究供试菌株5873是实验室前期筛选的优良大豆根瘤菌，并已对其完成了菌株的功能评价，目前正在申报农业农村部根瘤菌菌剂产品登记证，进行产业化推广。因此，以菌株5873为代表，根据已有的全基因组序列设计特异引物，通过PCR反应条件优化、特异性检测等试验，建立一种根瘤菌菌株水平的鉴定技术，既能实现菌株水平上的快速检测和知识产权保护，又能科学地鉴别、区分不同菌株，准确、快速地评价大豆根瘤菌剂是否具有高效竞争结瘤能力，为今后的菌株鉴定及功能评价提供了技术支持和方法参考。

发明内容

本发明的目的在于公开了大豆根瘤菌菌株5873 PCR鉴定方法。

本发明的第二个目的在于公开了上述鉴定方法所用的引物。

本发明的第三个目的在于公开了利用大豆根瘤菌菌株5873 PCR鉴定方法测定其在田间的占瘤率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

大豆根瘤菌菌株5873 PCR鉴定方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)、以引物4-4进行PCR扩增；所述引物序列为：

4-4-F：5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′，

4-4-R：5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′；

PCR扩增的模板选自以下3种模板中的一种：

(a)、待测菌株的基因组DNA，其中DNA浓度为7.5ng/μL以上；或