[发明专利]一种红树基因组DNA的高效提取方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种红树基因组DNA的高效提取方法。该提取方法对比于经典的CTAB法，在裂解植物细胞之前增加了去杂质buffer清洗过程。其中的去杂质buffer提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；并在此环境下，充分利用PEG8000聚集沉降红树叶片内的多糖、次级代谢产物等大分子，从而实现离心去除杂质的目的。大量实验表明，利用本发明的方法提取的DNA不再粘稠，琼脂糖电泳检测结果中DNA对应的条带清晰锐利、无明显拖尾，提取过程也相对容易、高效；同时，提取的DNA满足后续建库、上机测序、PCR反应等相关操作要求。本发明的提取方法显著提高了DNA提取效率和DNA纯度。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种红树基因组DNA的高效提取方法。

背景技术

红树属于盐生植物(在盐土或受盐水影响的土地上生长的植物)，能忍受较高的内部盐分浓度，不过大部分盐生植物均借着积聚一种脯氨酸(氨基酸的一种)来“平衡”渗透力，而红树积聚的则是低分子量碳水化合物。由于红树亦属于旱生植物，故必须保存水分，以减少吸收高盐分的海水。为了适应这种特殊的生境，红树的形态有以下特征：部分种类的红树叶内含有储水组织、蜡质的厚角质层和表皮、长在叶底的内陷气孔、板块根、一些叶子更布满钝圆的毛状体，以降低水分的流失。

基因组DNA的提取是分子生物学实验很重要的一个环节。基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。由于不同植物体内次生代谢物及比例不同，它们可以与DNA结合形成复合物，因此，对于不同的物种甚至不同的材料，需要有针对性地选择不同的提取方法，以获得高质量的DNA样品。一般陆地植物的DNA提取方法已经非常成熟，常见的有传统的CTAB法、SDS法等。而类似于红树这种海水生长、含有多糖多酚等次生代谢产物的植物，在用常规CTAB法提取时，研磨加入裂解液后提取液变得异常粘稠，最终得到的DNA存在大量的不溶物，导致提取出的DNA无法进行后续建库、上机中的纯化、PCR等步骤。具体问题表现在：磁珠纯化步骤中，磁珠抱团，最终无法洗脱下DNA；PCR扩增中，由于杂质过多导致PCR体系中的各成分无法充分接触DNA，从而扩增不出目的片段。因此，如何寻求一种红树基因组DNA的高效提取方法，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种红树基因组DNA的高效提取方法，该方法成本低、易操作、并最终获得高质量的红树基因组，方便后续的建库、上机以及PCR反应。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种红树基因组DNA的高效提取方法，包括：

(1)液氮研磨红树叶片至粉末；

(2)以去杂质buffer清洗粉末，每次清洗过后离心去上清，直到上清不粘稠为止；

(3)向清洗过后的红树粉末中加入裂解液，60-70℃裂解30-40min获得混合液a；所述裂解液配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；

(4)向混合液a中加入酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液a；

(5)向上清液a加入氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液b；

(6)向上清液b中加入异丙醇，充分混匀后静置、离心获得沉淀a；

(7)乙醇清洗沉淀a获得红树基因组DNA。

进一步地，所述去杂质buffer的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM EDTA、体积分数为5％甘油、质量分数为10％PEG8000。

进一步地，控制每克红树叶片粉末加入5-10mL所述的裂解液。