[发明专利]胺转氨酶AcATA突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

说明书

本发明公开了一种胺转氨酶AcATA突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，该胺转氨酶AcATA突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位进行单突变获得；其中，第122位的甲硫氨酸突变成组氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸。本发明通过分子对接和同源建模等方法获得可能影响其催化活性的位点，并进行了定点突变，最终得到的胺转氨酶AcATA突变体不仅具有较高的酶活，酶活均高于460U/g，均是野生型的4倍以上；而且能够高效催化西他列汀中间体前体酮1‑哌啶‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1,3‑二丁酮合成西他列汀中间体(R)‑3‑氨基‑1‑哌啶‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1‑丁酮，24h转化率高达90％。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及胺转氨酶AcATA突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用。

背景技术

西他列汀磷酸盐(Sitagliptin Phosphate)由美国Merck公司和Codexis公司研制和开发，是首个获得FDA批准用于治疗Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂(2016年10月)。西他列汀磷酸盐是II型糖尿病口服治疗药捷诺维(盐酸西他列汀片，JANUVIA)的活性成分，它主要通过抑制DPP-4对胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)的降解以达到治疗的目的，轻度增加GLP-1的含量并减弱GLP-1代谢物的拮抗作用。盐酸西他列汀在有效发挥降糖作用的同时不会引起因GLP-1含量过高而引起的恶心呕吐等副作用。同时，GIP可促进胰岛素分泌具有血糖依赖性，故能大大降低口服降糖药导致的低血糖副作用的发生率。其单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有明显的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反应少。

制备光学纯西他列汀及其中间体主要有化学合成法和生物酶法。

西他列汀的化学合成法主要有以下4条路线：

第一条路线为Kim D,Wang L,Beconi M,Eiermann GJ,Fisher MH,He H,et al.((2R)-4-Oxo-4-[3-(Trifluoromethyl)-5,6-dihydro[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl]-1-(2,4,5-trifluorophenyl)butan-2-amine:A Potent,Orally ActiveDipeptidyl Peptidase IV Inhibitor for the Treatment of Type 2Diabetes.Journal of Medicinal Chemistry.2005；48(1):141-51)发表的第一代西他列汀合成方法，该路线主要通过手性原料((2S)-(+)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪)诱导出手性α-氨基酸，再重氮化反应生成β-氨基酸来构筑手性中心。

第二条路线为Hansen K B(First Generation Process for the Preparationof the DPP-IV Inhibitor Sitagliptin[J].Org.process Res.dev,2005,9(5):634-639)发表的工艺路线，以手性磷根钌为催化剂不对称氢化β-酮酸酯构筑手性二级醇，手性二级醇再转化为手性二级胺。

第三条路线为美国默沙东公司的第三代合成方法，此方法以(S)-苯甘氨酰胺为手性助剂诱导加氢生成手性胺。

第四条路线是默沙东公司在WO2004085378和WO2005020920专利中发表的西他列汀最新一代化学合成方法。该路线以手性铑化物为催化剂不对称氢化烯胺获得手性胺结构，该方法是目前工业上化学合成西他列汀的主要方法。

美国专利US6699871公开了一种西他列汀中间体的化学合成方法，采用手性源来诱导出手性的alpha-氨基酸，而后通过重氮化反应产生beta-氨基酸来构建所需的手性中心。该路线所需的原料成本相对较高，反应较为麻烦，且产业化过程中工艺过程和产品质量都难以控制。