[发明专利]一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法

说明书

本申请公开了一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌，所述酵母菌的hem14基因不能正常表达。hem14基因功能缺失的酵母菌株KYD‑2在不补充氯高铁血红素的培养基中生长明显被抑制，而在KYD‑2中表达拟南芥PPO1后能够使其恢复生长，并且对乙氧氟草醚敏感。本发明还提供了该乙氧氟草醚敏感型酵母菌的制备方法及用途。本发明提供的方法制备的hem14缺陷酵母菌株解决了酵母对乙氧氟草醚不敏感的技术问题，可用于测试和比较具有乙氧氟草醚等PPO抑制剂类除草剂抗性基因的抗性水平。

技术领域

本申请涉及基因工程技术领域，具体而言涉及一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法。

背景技术

乙氧氟草醚是一种低毒、触杀型的原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogenoxidase，PPO)抑制型除草剂，在有光的情况下发挥其除草活性，分子式为C₁₅H₁₁ClF₃NO₄。在芽前和芽后早期施用效果最佳，对种子萌发的杂草杀草谱广，能防除阔叶杂草、莎草及稗，但对多年生杂草具有抑制作用。防治对象：可防除移栽稻、大豆、玉米、棉花、花生、甘蔗、葡萄园、果园、蔬菜田和森林苗圃的单子叶和阔叶杂草。

酵母(saccharomyce)是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，是遗传工程和细胞周期研究的模式生物，但是酵母本身对PPO抑制剂类除草剂乙氧氟草醚不敏感，因此难将其应用于筛选耐受乙氧氟草醚(或其他PPO抑制剂类除草剂)的抗性基因。

发明内容

在研究中发现将酵母细胞中与植物ppo基因具有相同功能的hem14基因破坏掉后，获得的hem14基因功能缺失的酵母菌株KYD-2在不补充氯高铁血红素的培养基中生长明显被抑制，而在KYD-2中表达拟南芥ppo1后能够使其恢复生长，并且对乙氧氟草醚敏感。因此酵母菌株KYD-2可用于鉴定植物ppo基因或在微生物中与之具备相同功能的基因对乙氧氟草醚(或其他PPO抑制剂类除草剂)的敏感性，用于筛选耐受乙氧氟草醚(或其他PPO抑制剂类除草剂)的抗性基因。

本发明公开了一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌，所述酵母菌的hem14基因不能正常表达。hem14基因功能缺失的酵母菌株KYD-2在不补充亚铁血红素的的培养基中生长明显被抑制，而在KYD-2中表达拟南芥PPO1后能够使其恢复生长，并且对乙氧氟草醚敏感。

在根据本发明的一个实施方案中，所述hem14基因中编码第120个氨基酸的密码子为TAG。

在根据本发明的一个实施方案中，所述hem14基因的序列为SEQ ID NO:2。该序列中将突变位点的下游相邻的密码子处设计了一个无义突变，使GGTTCC变为GGTACC，该突变后序列是KpnI识别的酶切位点，有利于鉴定检测。

本发明还提供了上述乙氧氟草醚敏感型酵母菌的制备方法，包括：

1)根据SEQ ID NO:2设计第一引物和第二引物，并使第一引物或第二引物中包含hem14基因的第358位碱基变异位点,并使所述第358位碱基变异位点由C变为T；

2)使用所述第一引物和第二引物扩增获得包含步骤1)所述变异位点的基因片段；

3)以步骤2)所述的基因片段构建重组载体；

4)将重组载体转化到酵母细胞中，使含有所述变异位点的基因片段通过同源重组或基因剪接的方式整合到hem14基因中。

在根据本发明的一个实施方案中，当通过基因剪接的方法进行时，重组载体的构建包括：

a)以pCAS为模板，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物扩增，获得核苷酸序列为SEQID NO:8的基因片段。

b)以pCAS为模板，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7为引物扩增，获得核苷酸序列为SEQID NO:9的基因片段；