[发明专利]一种结核病候选疫苗融合蛋白

说明书

本发明涉及一种结核分枝杆菌ESAT6基因与RV1498a基因嵌合蛋白Dodecin‑ESAT6候选疫苗的构建及其免疫原性研究,即利用基因工程技术将结核分枝杆菌ESAT6基因与RV1498a基因序列插入到同一大肠杆菌质粒pET28a的序列中,构建重组质粒rpET28a:RV1498a‑ESAT6。然后采用热激转化的方法将上述载体导入大肠杆菌,表达融合蛋白Dodecin‑ESAT6。本发明构建表达融合蛋白Dodecin‑ESAT6,其免疫原性优于ESAT6。本发明提供了一种融合蛋白Dodecin‑ESAT6的制备过程,并研究了其免疫原性,属于基因工程领域和结核疫苗领域。本发明将更有效的预防结核病的发生及传播。

技术领域:

本发明涉及基因工程领域和新型结核疫苗领域,具体涉及一种融合蛋白。

背景技术:

结核病(tuberculosis,TB)是一种严重危害人体健康的慢性传染病，由分枝杆菌(主要是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，又称“结核杆菌”(tuberclebacillus)导致。近年来人口流动、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌共感染、结核杆菌多重耐药性,等因素给结核病的防治提出了新的挑战。卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗,但是其免疫保护效果极不稳定,不同地区的人群接种BCG后其免疫保护作用差异很大(保护率为0-80％不等),亟需开发比BCG更为有效的结核病疫苗。

结核分枝杆菌6kD早期分泌抗原(6kDa early secreted antigenic target,ESAT6)是由RD(Regions of deletion,RD)1区的RV3875基因编码,该区只存在于少数致病性分枝杆菌基因组中,是BCG减毒传代过程中最先缺失的一段区域,与结核分枝杆菌毒力和抗原性相关,能被宿主免疫系统高度识别。ESAT6是RD1区编码的关键毒力蛋白，RD区缺失或敲除ESAT6会导致结核分枝杆菌毒力衰减，ESAT6可以诱发PPD皮肤试验阳性者的外周血单个核细胞出现增殖反应并产生IFN-γ,继而活化巨噬细胞,提高巨噬细胞对胞内结核菌的生长抑制作用和杀伤能力,可望成为新疫苗研制的主要候选分子。ESAT6编码基因中含有多个T细胞表位，而且每个位点都能诱发T细胞反应。ESAT6的B细胞表位位于多肽链N端，其中心区域与T细胞表位的中心序列相同。ESAT6因其较强的细胞免疫活性及独特的编码基因序列，有望成为新型疫苗的候选基因。Brandt等人将ESAT6蛋白质与佐剂二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)及单磷脂A(MPL)混合皮下注射免疫小鼠，结果显示ESAT6可作为抗结核亚单位疫苗的有效成分。Olsen等人发现加入DDA和MPL佐剂的ESAT6具有和BCG同等的保护效果。

Dodecin蛋白位于结核分枝杆菌基因组lipL基因附近，在结核分枝杆菌培养上清和培养基滤液和中被检测到，研究表明结核分枝杆菌Dodecin蛋白是可溶性分泌蛋白，Dodecin蛋白由结核分枝杆菌Rv1498a基因编码，研究表明其以十二聚体形式存在，可以耐受100℃温度不改变其多聚体结构。机体对结核病的免疫主要通过细胞免疫来完成,能引起免疫应答的抗原通常为大分蛋白，分子量小于10kd蛋白免疫原性极弱，不加佐剂ESAT6的只能诱导很弱的细胞免疫，可能与其分子量小有关。将Dodecin蛋白与ESAT6蛋白组成融合蛋白,不仅极大提高了分子量，而且通过多聚体形式成倍增加了ESAT6抗原表位，可以极大地提高免疫原性，克服Esat6蛋白免疫原性低的缺点，通过融合蛋白形式诱导强的细胞反应,选择其作为分子佐剂与结核分枝杆菌免疫关键抗原ESAT6重组,通过大肠杆菌原核表达可能具有更好的免疫原性和保护力的Dodecin-ESAT6融合蛋白作为候选疫苗,对今后结核新疫苗的开发、发病机制的研究及结核病的防治有重大意义。

发明内容:

本发明的目的是提供一种结核病候选疫苗融合蛋白和制备方法。