[发明专利]血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种人血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒。本申请采用飞行时间质谱平台，基于核酸分子在电场中飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空中的飞行时间而获得样品分析物的精准分子量，从而检测出HPA1～29SNP突变位点信息。结合多重PCR技术、单碱基延伸技术以及基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术进行分型检测。采用本申请的检测方法、引物和试剂盒，能够对29个血小板抗原HPA‑1～29基因多态性位点进行检测。检测方法准确、稳定。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒。

背景技术

人类血小板同种抗原(human patelet alloantigens，HPA)位于血小板膜糖蛋白上，这些蛋白是由遗传决定的，HPA的基因频率在不同种族、不同区域中的分布是不同的，研究HPA的基因多态性可以为人类学和遗传学等研究提供重要依据。至2016年，共计发现35个HPA，分别位于6个血小板GP分子上。按照国际输血协会的命名原则，可将35个HPA分为29个系统(或准系统)。国内外尚无能够对HPA1～29抗原基因进行较全面检测的商品试剂盒供应。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种人血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种血小板抗原基因分型的质谱检测方法，包括以下步骤：

(1)准备待测DNA；

(2)提供所有靶点SNP的扩增引物，使用多重PCR技术扩增含有目的SNP的DNA序列；

(3)对步骤(2)获得的扩增引物用碱性磷酸酶进行纯化处理，除去未结合的dNTPs；

(4)提供每个靶点SNP延伸引物，将混合好的延伸引物加入步骤(3)纯化后的产物中，以ddNTP为底物，进行单碱基延伸，每个SNP的等位基因延伸产物仅为末端一个碱基的差异；

(5)纯化步骤(4)获得的单碱基延伸的产物，并将产物转移到SpectroCHIP芯片上，进行质谱检测，确定其基因型。

进一步的，扩增引物包括正向引物和反向引物，正向引物、反向引物和延伸引物的序列如下表所示：

一种血小板抗原基因的引物组合，包括：序列如SEQ ID No:1-60所示的扩增引物和序列如SEQ ID No:61-90所示的延伸引物，如下表所示：

一种用于检测血小板抗原基因的试剂盒，包括上述的引物组合。

进一步的，进行血小板抗原基因分型时采用多重PCR。

进一步的，PCR反应体系为：每个PCR孔中加入0.5μmol/L PCR引物工作液1.0μL，RNase-free Water 0.8μL，含15mmol/L Mg²⁺的10×Buffer0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 0.4μL，25mmol/L dNTP 0.1μL，5U/μL HotstarTaq 0.2μL。

进一步的，PCR程序为：一个循环95℃，2min；45个循环95℃，30sec；56℃，30sec，72℃，1min；72℃，保持5min，12℃。

本申请采用飞行时间质谱平台，基于核酸分子在电场中飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空中的飞行时间而获得样品分析物的精准分子量，从而检测出SNP位点信息。结合多重PCR技术、单碱基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术进行分型检测。