[发明专利]快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，包括：

提取菌株DNA；

将提取菌株DNA及引物置于反应液内进行LAMP扩增反应；

所述反应液包含有引导物，所述引物分别为：

上游外引物F3：5’-TGGGGTTATTCTTTCGCT-3’；

下游外引物B3：5’-TTTCCAAGCTTACTGCAATT-3’；

上游内引物FIP：5’

-CCagCAAAacAGCCTAAATACATTG-TGGGGAGTATCTTTGAGAGG-3’；

下游内引物BIP：5’

-TTGGGATACTGTGCTATTTTTCTCT-GGGAAGATGAGAAATACGAGC-3’；

上游环引物LF：5’-CGCCTCCGTGATGAGGATG-3’；

下游环引物LB：5’-GCAGAAAAGGGCTAGCGC-3’；

LAMP扩增反应结束后，对反应液进行检测，以判断是否有高毒力肺炎克雷伯菌存在。

2.根据权利要求1所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述提取菌株DNA方法包括：

将实验细菌接种于MH琼脂平板上，并在培养箱内37℃过夜培养；

从MH琼脂平板上刮取适量细菌于500ul的经高压灭菌的双蒸馏水的EP管内，沸水浴10min；

在冰箱内冷却10min；

在4℃温度环境下，12000g离心10min后取上清液。

3.根据权利要求1所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述反应液的混合液配置为：

12.5μL 2×HNB LAMP混合液；

2.5μL 10×LAMP引物混合液；

0.8M甜菜碱；

1.0μL Bst DNA聚合酶；

1μL模板DNA；

25μL无菌水。

4.根据权利要求3所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述2.5μL 10×LAMP引物混合液浓度配置为：

上游外引物F3、下游外引物B3浓度分别为：0.5uM；

上游内引物FIP、下游内引物BIP分别浓度为：8uM；

上游环引物LF、下游环引物LB分别浓度为：2uM。

5.根据权利要求4所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，LAMP扩增反应的反应条件为：

将LAMP扩增反应的混合液置于水浴环境下；

反应温度为：55～85℃之间，每5℃一个梯度；

反应时间为：40～70min之间，每5min一个梯度。

6.根据权利要求5所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，LAMP扩增反应的反应条件具体为：

反应温度为：65℃；

反应时间为：60min；

终止反应温度为：85℃；

终止反应时间为：5min。

7.根据权利要求1至6任意一项所述的快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法，其特征在于，所述对反应结果进行检测，以判断是否有高毒力肺炎克雷伯菌存在包括：

取反应液，并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，若有梯度条带处在，且最小条带为180bp，则说明有高毒力肺炎克雷伯菌存在，否则，则说明没有高毒力肺炎克雷伯菌存在；

或者，取反应液加入SYBR green I荧光检测，若反应液出现绿色，则说明有高毒力肺炎克雷伯菌存在，否则，则说明没有高毒力肺炎克雷伯菌存在。