[发明专利]一种提高抗体荧光染料标记信号的方法

说明书

本发明的目的在于提高一种提高抗体荧光染料标记信号的方法，该方法包括如下步骤：步骤1)将抗体的巯基氨基化；步骤2)用荧光染料标记抗体；本发明通过巯基氨基化的方法，在蛋白或抗体上的自由巯基上增加了自由氨基后再进行小分子荧光标记，提高了荧光标记的效率与最终的荧光染色信号。

技术领域

本发明属于抗体标记领域，具体涉及一种提高抗体荧光染料标记信号的方法。

背景技术

蛋白及抗体类生物大分子的小分子荧光标记，传统的标记反应通过小分子荧光染料(FITC,iFluor系类染料，alexafluor系列染料等)的琥珀酰亚胺酯与蛋白或抗体上的自由氨基反应形成酰胺键共价偶联，染色荧光效果受到蛋白或抗体上自由氨基数量的限制。

发明内容

本发明的发明人通过巯基氨基化的方法，在蛋白或抗体上的自由巯基上增加了自由氨基后再进行小分子荧光标记，提高了荧光标记的效率与最终的荧光染色信号。基于此，本发明的目的在于提高一种提高抗体荧光染料标记信号的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1)将抗体的巯基氨基化；步骤2)用荧光染料标记抗体。

在一些实施方式中，所述抗体上的巯基通过卤代烷基胺进行氨基化反应。

在一些实施方式中，所述的卤代烷基胺选自溴乙胺、氯乙胺、碘乙胺；在本发明一些具体实施例中，采用溴乙胺与抗体进行烷基化反应，具体反应如下：

在一些具体实施方式中，所述的荧光染料为FITC、iFluor系类染料，alexafluor系列染料。

在一些具体实施方式中，所述步骤1)具体包括：向抗体中加入碳酸氢钠溶液，混合均匀后再加入溴乙胺溶液反应，使得溴乙胺分子与抗体的游离巯基反应；

将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入PBS缓冲液、离心并除去滤液，再加入PBS缓冲液混匀离心，多次此操作，通过脱盐使抗体中未反应溴乙胺残余量至少为抗体总量的10^-3倍以上；在一些具体实施例中，向200ug抗体中加入100uL 1M碳酸氢钠溶液，混合均匀后再加入1.4uL 50mM溴乙胺溶液，25℃反应过夜，使得溴乙胺分子与Ab分子中的游离巯基反应；

将反应完成后溶液移至超滤离心管内，再加入500uL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液5min、12000g离心并除去滤液，再加入500uL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使抗体中未反应溴乙胺残余量至少为抗体总量的10^-3倍以上，尽可能较多稀释。

在一些具体实施例中，所述步骤2)具体包括：1、向预反应抗体溶液中加入1/10的1M碳酸氢钠缓冲液；2、iFluor荧光染料规格为1mg每管，分子量为1000，每管加入100uLDMSO溶解终浓度为10mM，将其分装为每管5uL，放置于-20℃保存；3、向步骤2准备好的蛋白溶液加入1.5uL荧光染料中(n(染料)：n(蛋白)＝15:1)，轻轻晃动使染料充分溶解；将溶液避光放置于25℃环境中，反应1h；4、超滤离心管分离纯化；4.1将0.5mL 50kd超滤离心管内管装入收集管内，将反应完成的溶液全部转移至超滤离心管内管之中，补加400uL PBS(含0.01％NaN₃)，14000g 10min离心；4.2将收集管内的液体倒入废液桶内，向内管之中加入500uL PBS(含0.01％NaN₃)，14000g 10min离心，丢弃收集管内的废液，重复此次试验步骤5-6次，直至收集管内的废液颜色不在显示为绿色；