[发明专利]一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用

权利要求书

1.一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、将带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌经发酵及粗提后得到EDDS裂合酶的粗酶液；

B、将得到的EDDS裂合酶的粗酶液与金属亲和载体接触，使含有His-tag的EDDS裂合酶吸附到金属亲和载体上进行纯化处理；再将金属亲和载体上的带上His-tag的EDDS裂合酶进行洗脱，得到纯化后的带有His-tag的EDDS裂合酶的酶液；

C、将带有His-tag的EDDS裂合酶的酶液和固定化载体进行固定使酶结合到固定化载体上，得到带有His-tag的EDDS裂合酶固定化酶,所述固定化载体为经过戊二醛活化的氨基载体。

2.根据权利要求1所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，所述带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，所述带上His-tag的EDDS裂合酶蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1或2或3所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤B中所述金属亲和载体选自Ni离子或钴离子活化的LX-1000IDA、Seplite LX-1000IDA、FP-IDA405/EB或Ni-IDA-Sefinose Resin。

5.根据权利要求1或2或3所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤B所述纯化处理具体为：

将得到的含有His-tag的EDDS裂合酶的粗酶液作为上柱液流过预装有金属亲和载体的柱子，使含有His-tag的EDDS裂合酶吸附在金属亲和载体上。

6.根据权利要求5所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，所述上柱液中含有15-30mM的咪唑。

7.根据权利要求5所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤B中所述洗脱采用的洗脱液中含有咪唑200-1000mM。

8.一种EDDS裂合酶固定化酶的应用，其特征在于，所述EDDS裂合酶固定化酶用于以富马酸和乙二胺为底物合成(S,S)-EDDS，所述EDDS裂合酶固定化酶为带有His-tag的EDDS裂合酶固定化酶,所述EDDS裂合酶固定化酶的固定化载体为经过戊二醛活化的氨基载体。

9.根据权利要求8所述EDDS裂合酶固定化酶的应用，其特征在于，所述底物配制成反应底物混合液，所述反应底物混合液包括以下成分的浓度：

富马酸：400-2000mmol/L；乙二胺盐酸盐：200-1000mmol/L；Mg²⁺：800-1200mmol/L。