[发明专利]一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用，属于生物技术领域。为了解决现有的纯度差和转化率不高的问题，提供一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，该方法包括将带有His‑tag的EDDS裂合酶的基因工程菌经发酵及粗提后得到EDDS裂合酶粗酶液；粗酶液与金属亲和载体接触，使EDDS裂合酶吸附到金属亲和载体上进行纯化；将金属亲和载体上的EDDS裂合酶进行洗脱，得到纯化后的酶液；将酶液和固定化载体进行固定，得到带有His‑tag的EDDS裂合酶固定化酶，用于以富马酸和乙二胺为底物合成(S,S)‑EDDS。本发明能有效除去酶液中富马酸酶，起到高效纯化效果；且有高效酶活能力和高重复利用率。

技术领域

本发明涉及一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

乙二胺二琥珀酸(Ethylenediamine N,N'-disuccinic acid,EDDS,CAS：2084691-7)是一个天然的生物源氨基多羧酸类螯合剂，广泛用于洗涤剂、化妆品及重金属污染土壤修复。EDDS分子结构中含有2个手性中心，具有(S,S)-EDDS、(R,S)-EDDS和(R,R)-EDDS三种异构体，其中仅(S,S)-EDDS可以完全生物降解。

目前，(S,S)-EDDS主要采用化学法进行生产，生物法合成(S,S)-EDDS的报道也较多，比如1984年，nishikiori等从fungus culture中分离到(S,S)-EDDS，ENDO等利用天冬氨酸氨裂合酶合成R,S-EDDS。更多的报道是利用微生物EDDS lyase催化富马酸和乙二胺合成(S,S)-EDDS。

该酶是一种精氨琥珀酸裂合酶，属于典型的aspartase/fumarase超家族成员，可以催化EDDS的降解反应，也可以催化EDDS及其类似物的合成反应。

已有的文献报道多数是利用微生物菌体酶来合成(S,S)-EDDS，比如Takahashi R及Kaneko Makoto等分别利用微生物Acidovorax TNT149、Pseugomonas sp.TN-131菌体酶合成了90mmol/L和93mmol/L的EDDS。也有些报道利用重组EDDS lyase的基因工程菌来进行(S,S)-EDDS的生物合成，分别得到了50mM、450mM的EDDS。

一些研究着力于提高酶的稳定性和催化效率。如来自Brevundimonas diminutaMR-E001的EDDS lyase热稳定性差，50℃30分钟即可使其失活，Akiyama T等报道了热稳定性提高的EDDS裂合酶序列，该酶在50℃30分钟条件下可保持72％的活性。2004年，Shigeho等报道了利用固定化基因工程菌进行EDDS的合成，反应可以重复100批。微生物菌体中除了EDDS裂合酶，还会含有较高的富马酸酶活性，可以将反应的底物之一富马酸转化为苹果酸，这会大大降低EDDS的合成效率，转化能力差。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用，为了解决的问题是如何使具有高纯的EDDS裂合酶，且能够提高EDDS裂合酶催化转化能力和重复利用性。

本发明的目的之一通过以下技术方案得以实现的，一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、将带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌经发酵及粗提后得到EDDS裂合酶的粗酶液；

B、将得到的含带有His-tag的EDDS裂合酶的粗酶液与金属亲和载体接触，使带有His-tag的EDDS裂合酶吸附到金属亲和载体上进行纯化处理；再将金属亲和载体上的带上His-tag的EDDS裂合酶进行洗脱，得到纯化后的带有His-tag的EDDS裂合酶的酶液；

C、将带有His-tag的EDDS裂合酶的酶液和固定化载体进行固定使酶结合到固定化载体上，得到带有His-tag的EDDS裂合酶固定化酶。