[发明专利]一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用

权利要求书

1.一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将菲律宾蛤仔于0～4℃环境中培育至少一个月，取菲律宾蛤仔肉，用水清洗后保存备用；

(2)菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取：菲律宾蛤仔肉与的缓冲液按1:2.8～3.2(m/v)的比例混合、匀浆，所得匀浆液离心后保留上清液，向上清液中加入水至体积与离心前匀浆液的体积相同，保存备用；

(3)制备冰壳：在圆底烧瓶中加入去离子水，在液氮-无水乙醇浴或无机盐-水-冰混合浴中匀速旋转圆底烧瓶60～80s，使去离子水在圆底烧瓶内壁形成厚度均匀的冰壳，其中，形成冰壳的去离子水体积为初始去离子水体积的1/3～1/5；将剩余的去离子水倒出，再次将圆底烧瓶放入液氮-无水乙醇浴中匀速旋转20～40s，使圆底烧瓶内的冰壳完全冻结并形成裂缝；

(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化：

第一次纯化：将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中，在-1～-1.5℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；

第二次纯化：将第一次纯化后的冰壳于室温下融化后，加入体积比为1:4～5的缓冲液和去离子水，然后倒入另一冰壳中，在-0.5～-2℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；

第三次纯化：重复一次第二次纯化的步骤；

(5)收集抗冻蛋白：将步骤(4)第三次纯化后所得产物于室温下融化后，用透析袋浓缩至体积为透析前的1/10，浓缩液离心，上清液冷冻干燥，即得抗冻蛋白。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的菲律宾蛤仔选用规格一致且健康完整的；保存温度为-80～4℃。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述缓冲液温度均为0～4℃；所述缓冲液均由50mM pH 8.0Tris-HCl、100mM NaCl、1mM苯基硫脲、1mM乙二胺四乙酸和0.1mM苯甲基磺酰氯组成。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述匀浆的时间为30～60s；步骤(2)所述离心的条件为0～4℃20000g离心30～40min；步骤(2)所述保存温度为0～4℃。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述去离子水的温度为0～4℃；步骤(3)所述的液氮-无水乙醇浴为：在装有液氮的无盖容器中放入装有无水乙醇的无盖容器，圆底烧瓶在装有无水乙醇的无盖容器中匀速旋转形成冰壳；步骤(3)所述无机盐-水-冰混合浴中的冷却剂为：无机盐：水：冰比例为10:2:5(m/v/m)，所述无机盐包括氯化钙。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)第一次纯化中将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中的方法包括：将长颈漏斗插入圆底烧瓶中心后倒入粗提液或使用注射器注入粗提液，向冰壳中倒入或注入粗提液的时间为1-2min。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中的低温浴中添加有浴液，所述浴液包括无水乙醇；步骤(4)所述去离子水的温度为0～4℃。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)透析的温度为0～4℃；步骤(5)所述透析袋的截留分子量是14000MwCO；步骤(5)所述离心的条件为0～4℃12000～15000g离心0.8～1h。

9.权利要求1-8中任一项所述的提取方法提取得到的菲律宾蛤仔抗冻蛋白。

10.权利要求9所述的菲律宾蛤仔抗冻蛋白在制备食品添加剂和抗冻剂中的应用。