[发明专利]一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用

说明书

本发明公开了一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用，属于生物技术领域。所述提取方法包括如下步骤：(1)菲律宾蛤仔于4℃环境中培育后取肉；(2)提取菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取(3)制备冰壳(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化(5)收集抗冻蛋白。本发明所述方法提取方法易于操作，纯化过程简单且用时短，所得产品纯度高，更有利于实际生产，增加了产能，降低了成本。

技术领域

本发明涉及一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

菲律宾蛤仔对低温胁迫是一种积极主动地应激过程。抗冻蛋白(AntifreezeProtein，AFP)是一类能够抑制冰晶生长和重结晶的蛋白质，它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，这种引起的熔点与冰点的差值称为热滞活性，因而抗冻蛋白亦称为热滞蛋白。抗冻蛋白在植物、海洋鱼类、昆虫和微生物中均有分布，目前没有发现从菲律宾蛤仔提取抗冻蛋白的报道。

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)属软体动物门，双壳纲、帘蛤目、帘蛤科。是广泛生活于中国南北沿海的埋栖贝类，具有重要的经济价值。目前在世界约200万吨的菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)产量中，约90％来

自于养殖，且主要来自我国大陆的养殖(Goulletquer,1997)。在中国北方，蛤仔养殖过程中要经历冬季的低温，甚至冰冻，生存环境极差，但仍有菲律宾蛤仔正常越冬，体现了较强的抗寒性，是能够适应中国北方海域低温的优良经济贝类。

目前，抗冻蛋白分离纯化主要有传统层析分离方法、SDS-PAGE电泳和浊点萃取法。传统方法分离周期长、过程繁琐、得率低、分离工艺不稳定、耗资昂贵和重复性差等缺点。

发明内容

本发明采用冰特异性吸附分离的方法提取了菲律宾蛤仔抗冻蛋白，冰特异性吸附分离法利用了冰对抗冻蛋白的特异吸附性，经一步分离步骤即可使抗冻蛋白的纯化倍数显著提高，比传统的色谱方法更加快捷高效，也能够避免造成抗冻活性的损失。

一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白的提取方法，包括如下步骤：

(1)将菲律宾蛤仔于0～4℃环境中培育至少一个月，取菲律宾蛤仔肉，用水清洗后保存备用；

(2)菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取：菲律宾蛤仔肉与的缓冲液按1:2.8～3.2(m/v)的比例混合、匀浆，所得匀浆液离心后保留上清液，向上清液中加入水至体积与离心前匀浆液的体积相同，保存备用；

(3)制备冰壳：在圆底烧瓶中加入去离子水，在液氮-无水乙醇浴或无机盐-水-冰混合浴中匀速旋转圆底烧瓶60～80s，使去离子水在圆底烧瓶内壁形成厚度均匀的冰壳，其中，形成冰壳的去离子水体积为初始去离子水体积的1/3～1/5；将剩余的去离子水倒出，再次将圆底烧瓶放入液氮-无水乙醇浴中匀速旋转20～40s，使圆底烧瓶内的冰壳完全冻结并形成裂缝；

(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化：

第一次纯化：将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中，在-1～-1.5℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；

第二次纯化：将第一次纯化后的冰壳于室温下融化后，加入体积比为1:4～5的缓冲液和去离子水，然后倒入另一冰壳中，在-0.5～-2℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；；

第三次纯化：重复一次第二次纯化的步骤；

(5)收集抗冻蛋白：将步骤(4)第三次纯化后所得产物于室温下融化后，用透析袋浓缩至体积为透析前的1/10，浓缩液离心，上清液冷冻干燥后得到白色粉末即为抗冻蛋白。