[发明专利]检测胶质瘤中基因甲基化的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的检测胶质瘤中基因甲基化的方法，其特征在于，所述基因为MGMT、CDKN2A/P16和TERT，该方法包括以下步骤：

(1)用特异性识别和切断未甲基化位点的限制性内切酶处理胶质瘤DNA样品，获得酶切产物，其中，相对于1ng的以DNA重量计的胶质瘤DNA样品，所述限制性内切酶的用量为0.01-0.05U，所述限制性内切酶为HpaII；

(2)通过PCR扩增所述酶切产物，获得含荧光素的PCR产物，PCR扩增的条件使得所述基因得到扩增；

其中，所述PCR扩增分两轮进行，第一轮PCR扩增以步骤(1)所得酶切产物作为DNA模板进行，在第一轮PCR中，MGMT基因的循环数为17，CDKN2A/P16基因的循环数为17，TERT基因的循环数为25；

第二轮PCR扩增以第一轮PCR产物为DNA模板进行，将荧光素标记的F1-脱氧核糖核苷三磷酸加入到扩增体系中，获得含荧光素的PCR产物；

所述PCR扩增中所用的引物为：

MGMT基因：正向引物5’-CTGTG ACAGG AAAAG GTACG GG-3’，反向引物5’-AGTCT GCGCATCCTC GCTG-3’；

CDKN2A/P16基因：正向引物5’-TCCTT CCTTG CCAAC GCT-3’，反向引物5’-GCCCC TCCTCTTTCT TCCTC-3’；

TERT基因：正向引物5’-GCGTG CGGCG ACCCT TTG-3’，反向引物5’-GCCTC CGTCC TCCCCTTCA-3’；

(3)将所述含荧光素的PCR产物与阳离子共轭聚合物结合，以使PCR产物发生荧光能量共振转移，并分别检测阳离子共轭聚合物和荧光素的荧光强度，所述结合的方法包括：在室温下，将含荧光素的PCR产物与阳离子共轭聚合物立即混合，所述含荧光素的PCR产物与阳离子共轭聚合物的重量比为1：6-7，其中，所述阳离子共轭聚合物为阳离子聚芴衍生物，所述室温为25-35℃；

所述阳离子聚芴衍生物的结构如所示，其中，R为n＝3-100；

(4)根据所述荧光强度计算胶质瘤中基因甲基化水平E值，所述E值的计算公式如式(1)所示：

其中，FRET_HpaII为使用限制性内切酶处理后的样品的424nm处阳离子共轭聚合物和528nm处荧光素的荧光强度比值，FRET_空白为不加入胶质瘤DNA样品，仅使用无菌水进行的空白实验组424nm处阳离子共轭聚合物和528nm处荧光素的荧光强度比值，FRET_non-HpaII为加入胶质瘤DNA样品但不使用所述限制性内切酶处理的空白对照组的424nm处阳离子共轭聚合物和528nm处荧光素的荧光强度比值；

(5)建立甲基化程度定量标准化曲线，确定检测条件，并按照步骤(1)-(4)在相同检测条件下对待检测的胶质瘤DNA样品进行检测；

(6)判定所述胶质瘤DNA样品中MGMT、CDKN2A/P16和TERT基因的甲基化程度，并进行联合分析，以评估胶质瘤CpG岛甲基化表现型。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，第二轮PCR扩增后，经碱性磷酸酶处理去除多余的F1-脱氧核糖核苷三磷酸，其中，相对于1ng的以第一轮PCR中DNA模板重量计，碱性磷酸酶的添加量为0.1-0.5U。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(5)中，所述甲基化程度定量标准化曲线通过利用DNA甲基化/非甲基化标准品进行测量获得。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述甲基化程度定量标准化曲线通过利用人的DNA甲基化/非甲基化标准品进行测量获得。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(6)中，所述胶质瘤CpG岛甲基化表现型通过所述胶质瘤中基因的甲基化水平E值的赋值相加获得；

所述甲基化水平E值的赋值的定义方式包括：通过分析胶质瘤样本和正常样本的甲基化水平，将甲基化水平分为三个区间，每个区间分别赋值为1、2、3。