[发明专利]检测胶质瘤中基因甲基化的方法

说明书

本发明涉及基因检测领域，公开了一种检测胶质瘤中基因甲基化的方法，该方法包括以下步骤：(1)用特异性识别和切断未甲基化位点的限制性内切酶处理DNA标准品；(2)通过PCR扩增所述酶切产物；(3)将PCR产物与阳离子共轭聚合物结合，以使PCR产物发生荧光能量共振转移，并分别检测阳离子共轭聚合物和荧光素的荧光强度；(4)根据所述荧光强度计算胶质瘤中基因甲基化水平E值；(5)建立甲基化程度定量标准化曲线，确定最优检测条件，并在最优检测条件下对待检测的胶质瘤DNA样品进行检测；(6)判定所述胶质瘤DNA样品的甲基化程度，进行联合分析，评估胶质瘤CpG岛甲基化表现型。该方法可以实现高灵敏、低成本检测胶质瘤基因的甲基化程度的目的。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种检测胶质瘤中基因甲基化的方法。

背景技术

启动子甲基化是抑癌基因转录沉默最重要、最常见的机制，是肿瘤形成和进展的关键因素。综合胶质瘤多个关键基因MGMT，CDKN2A/P16，TERT启动子甲基化水平，可以辅助胶质瘤的诊断及患者预后的判断。而目前胶质瘤启动子甲基化检测的手段，主要包括甲基化特异性PCR(MSP)，MethyLight，高分辨率溶解曲线(HRM)，结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析(COBRA)，焦磷酸测序等，它们大部分需要重亚硫酸盐处理，过程繁琐，灵敏性低，且花费大。甲基化特异性PCR(MSP)是定性检测方法，只能判断有无甲基化。MethyLight-PCR是在MSP基础上的改进，实现了荧光定量检测，但需要设计荧光探针，花费大，设计繁琐，且在检测过程中容易出现假阳性；亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)需要专业技术人员长时间的分离和转化，需要昂贵的设备，难以推广。焦磷酸测序实现了定量、高通量的检测，但读取长度有限，受到了酶的热不稳定性的制约。因此，迫切需要开发检测时间短、高灵敏、低成本的胶质瘤基因甲基化检测技术。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的胶质瘤基因甲基化检测中的灵敏度不足、成本高、依赖专业设备和人员的问题，提供一种检测胶质瘤中基因甲基化的方法，该方法利用阳离子共轭聚合物(CCP)为基础的荧光能量共振转移(FERT)技术，建立胶质瘤关键基因MGMT，CDKN2A/P16，TERT启动子甲基程度的定量标准曲线，实现高灵敏、低成本检测胶质瘤基因的甲基化程度。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种检测胶质瘤中基因甲基化的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用特异性识别和切断未甲基化位点的限制性内切酶处理DNA标准品，获得酶切产物；

(2)通过PCR扩增所述酶切产物，获得含荧光素的PCR产物；

(3)将所述PCR产物与阳离子共轭聚合物结合，以使PCR产物发生荧光能量共振转移，并分别检测阳离子共轭聚合物和荧光素的荧光强度；

(4)根据所述荧光强度计算胶质瘤中基因甲基化水平E值；

(5)建立甲基化程度定量标准化曲线，确定最优检测条件，并按照步骤(1)-(4)在最优检测条件下对待检测的胶质瘤DNA样品进行检测；

(6)判定所述胶质瘤DNA样品的甲基化程度，并进行联合分析，以评估胶质瘤CpG岛甲基化表现型。

通过上述技术方案，本发明能够实现胶质瘤细胞，尤其是体外培养的胶质瘤细胞中基因甲基化的快速、高灵敏度、低成本的检测。

附图说明

图1是阳离子共轭聚合物为基础的荧光能量共振转移技术检测基因甲基化的原理图。