[发明专利]明胶海绵及其制备方法及储存方法

说明书

本发明揭示了一种明胶海绵及其制备方法及储存方法，所述制备方法包括：由牛屈肌腱纤维胶原蛋白与氰酸和甲醇的混合物混合，经孔泵送同质化，制备明胶混合物；以及，将所述明胶混合物与海绵黏附形成所述明胶海绵。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种具有高的生物相容性的，能够支持肿瘤组织/或细胞三维生长的明胶海绵、制备方法及储存方法。

背景技术

体外三维培养是一种将细胞、生长因子与再造基质蛋白共培养的实验技术，现已广泛运用到生物医学研究的各个领域。作为体外无细胞系统及单层细胞系统研究与组织器官及整体研究之间的桥梁，它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控制性的优势。目前研究发现，三维培养状态下的人肿瘤细胞在生物学特性、基因表达、裸鼠成瘤等方面与二维培养的肿瘤细胞明显不同，其显示了细胞三维形态结构及微环境对肿瘤细胞生物学功能的维持具有重要作用。

早期体外组织培养是在鸡血浆凝块-海绵复合体上进行的，该培养方法存在一定的局限性，即肿瘤组织在鸡血浆凝块-海绵复合体的液体浸泡区生长更为密集，而不是在整个海绵中以均匀分布的增殖细胞生长；更严重的是，一些上皮炎，包括肿瘤组织存在溶解鸡血浆凝块的现象，当鸡血浆凝块发生溶解时，大多数在鸡血浆凝块-海绵上生长出来的肿瘤细胞类型不会粘附在纤维素海绵上，而是在粘附在培养箱中或更换培养基时被流失到培养基中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可作为肿瘤组织/或细胞三维结构生长的支架，解决了现有肿瘤组织/或细胞通用培养方法中，其肿瘤组织/或细胞的生物学特性，例如增殖能力、分化能力、迁移及细胞与细胞外基质信号传递相互作用等行为学丢失的现象。

为实现上述发明目的之一，本发明一实施方式提供一种支持肿瘤组织/或细胞三维生长的明胶海绵的制备方法，所述制备方法包括：

由牛深层屈肌腱纤维胶原蛋白与氰酸和甲醇的混合物混合，经孔泵送同质化，制备明胶混合物；以及

将海绵与该明胶混合物黏附形成明胶海绵。

作为可选的技术方案，所述明胶混合物制备包括：

步骤S1：胶原蛋白原材料前处理，所述胶原蛋白原材料为牛深层屈肌腱；

步骤S2：胶原蛋白原材料酶解，获得牛深层屈肌腱纤维胶原蛋白；

步骤S3：胶原蛋白盐析纯化，提纯牛深层屈肌腱纤维胶原蛋白；

步骤S4：同质化牛深层屈肌腱纤维胶原蛋白；

步骤S5：制备明胶混合物；以及

步骤S6，储存所述明胶混合物。

作为可选的技术方案，所述步骤S1中胶原蛋白原材料前处理包括：

剔除牛深层屈肌腱中的筋膜、脂肪、肌肉表面非胶原蛋白和其他无关物质，自来水清洗后，冷冻，于切片机上沿着垂直于牛深层屈肌腱的纵轴切成厚度为 0.4-1㎜的片块。

作为可选的技术方案，所述片块的厚度为0.6㎜。

作为可选的技术方案，所述步骤S2：胶原蛋白原材料酶解包括：

按照0.5-2mg/g配比将无花果蛋白酶溶解于pH为7.0-8.0、浓度为 0.02-0.5mol/L磷酸盐缓冲液中形成酶解液1；将经步骤S1处理的牛深层屈肌腱的片块置入酶解液1中，于35-38℃下搅拌，搅拌时间1-3小时；经蒸馏水清洗 0.5-2小时，制得牛深层屈肌腱纤维胶原蛋白；其中，每g牛深层屈肌腱的的片块添加0.5-2mg的无花果蛋白酶。