[发明专利]一种用于面部提升的皮肤成纤维细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.一种用于面部提升的皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，主要包括自体脂肪干细胞的获取及培养步骤及皮肤成纤维细胞制备步骤，所述的自体脂肪干细胞的获取及培养步骤如下：将取得的皮下脂肪组织放入离心管后移至离心机进行离心作业，而后使用PBS缓冲液冲洗浸泡，再置于离心机中进行离心作业，步骤重复三次，将离心管由离心机中取出，剔除试管内肉眼可见的血管以及结缔组织后使用剪刀将离心管内剩余物质剪碎成小块，置于离心管中，加入两倍体积的胶原酶，一倍体积的双抗，封口后置于摇床中消化后加入等体积的低糖DMEM终止消化并移至离心机中进行离心，离心后在离心管内分为三层，取最下层液体加入完全培养基重悬，使用细胞筛网过滤，过滤后细胞浓度调整为6x10⁵单核细胞/mL，接种于T25，培养条件为37℃，5%CO₂，饱和湿度，当T25中的细胞生长至90%融合时，胰蛋白酶将细胞以1∶2或1∶3传代继续培养后得到自体脂肪干细胞；

所述的皮肤成纤维细胞制备步骤如下：

步骤1：吸出细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

步骤2：添加胰蛋白酶消化液至培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，温水浴后倒置于显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入完全培养基终止消化；

步骤3：用吸管轻轻吹打混匀，按比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

步骤4：待细胞完全贴壁后，培养观察；之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基；

步骤5：将得到的第二代或者第三代干细胞转入条件培养基进行细胞诱导，经过约7-10天，能够将干细胞诱导为皮肤成纤维细胞。

2.根据权利要求1所述的一种用于面部提升的皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，将皮肤成纤维细胞与生理盐水相混合即可得到注射用皮肤成纤维细胞制剂。

3.根据权利要求1所述的一种用于面部提升的皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，进一步的，所述的细胞传代操作步骤均需在严格无菌条件下操作。

4.根据权利要求1所述的一种用于面部提升的皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，进一步的，所述的自体脂肪干细胞的获取及培养步骤如下：将取得的200mL皮下脂肪组织放入离心管后移至离心机在800g条件下离心5min，而后使用PBS缓冲液冲洗浸泡，再置于离心机中在800g条件下离心5min，此步骤重复三次，在离心管中剔除肉眼可见的血管以及结缔组织，使用剪刀将离心管内剩余物质剪碎成1.0-2.0 mm³的小块，置于50mL离心管中，加入两倍体积的0.5%胶原酶，1倍体积的1%双抗，封口后置于37℃摇床中消化1h，加入等体积的低糖DMEM终止消化，放入离心机中在1500r/min条件下离心10min，离心后离心管内分为三层，取最下层液体加入完全培养基重悬，使用70μm细胞筛网过滤，过滤后细胞浓度调整为6x10⁵单核细胞/mL，接种于T25，培养条件为37℃，5%CO₂，饱和湿度，当T25中的细胞生长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶将细胞以1∶2或1∶3传代继续培养即可得到自体脂肪干细胞。

5.根据权利要求4所述的一种用于面部提升的皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，进一步的，所述的低糖DMEM为10%胎牛血清。

6.根据权利要求1所述的一种用于面部提升的皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，进一步的，在上述步骤2中，添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温水浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化。