[发明专利]一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液；所述绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特异引物包括扩增绿脓杆菌的特异引物ETA-F1和ETA-R1、扩增金黄色葡萄球菌的特异引物nuc-F1和nuc-R1、扩增大肠杆菌的特异引物LacZ-F1和LacZ-R1、用于扩增沙门氏菌的特异引物invA-F1和invA-R1；所述特异引物的核苷酸序列依次为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，dNTPs。

3.一种利用权利要求1-2中任一项所述试剂盒的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)不同剂型化妆品模拟污染样品DNA模板制备，包括：

（a）亲水性样品：将无菌的化妆水或乳液样品在钠盐培养基中混匀，添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸，

（b）疏水性样品：取唇膏或粉底液样品加入灭菌矿物油和灭菌tween80中匀浆，添加灭菌生理盐水，充分混匀加入到钠盐培养基中得混合液，取上述混合液添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸；

(2)多重PCR反应体系配置，所述反应体系包括PCR反应混合液5μL，四种靶标菌特异引物混合液2μL，步骤（1）提取的DNA模板1.0 μL，ddH₂O补足25μL；

(3)采用多重PCR法进行扩增；

(4)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，将5μL所述扩增反应产物用1％琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小判定结果。

4.根据权利要求3所述的快速检测方法，其特征在于：所述步骤（2）的多重反应体系配置每批次试验加入阳性质控品或阴性质控品代替模板做试验对照。

5.根据权利要求3所述的快速检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中多重PCR法进行扩增的扩增条件为94℃，4min；94℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 45s，共32循环；最后72℃后延伸5min。

6.根据权利要求3所述的快速检测方法，其特征在于：所述检测方法对不同剂型化妆品模拟污染样品增菌后检出限均可达到10⁰cfu/mL。