[发明专利]一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种化妆品特性菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法，利用绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异基因保守区序列设计出适用于多重PCR的引物，用多重PCR技术一次性检测化妆品中的特定菌绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌。解决了化妆品中特定病原菌传统技术检测周期长，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低的问题，设计的引物与多重PCR体系组装成试剂盒，用于化妆品特定菌的快速检测，该检测方法特异性好，与对照相似致病菌无交叉反应，且灵敏度高，对不同剂型化妆品模拟污染样品增菌后检出限均可达到10⁰cfu/mL,满足了对化妆品特定菌零检出的要求，而且快速、方便。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

特定菌(Specia microorganism)是化妆品中不得检出的特定微生物，包括致病菌和条件致病菌。有关特定菌的确定，目前世界尚无统一规定，各国有所不同。目前，中国则按照2007年修订的《化妆品卫生规范》，该规范规定的特定菌，即不得检出的致病微生物是3种：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和粪大肠菌群。国外的化妆品质量保证主要是按照欧盟的消费品科学委员会(SCCP)或美国食品药品监督管理局(FDA)的规定执行，其中包括沙门氏菌。而粪大肠菌群与总大肠菌群组成相同，主要组成是埃希氏菌属，而此菌属中与人类生活密切相关的就只有大肠杆菌。

目前化妆品中微生物的检测手段除传统的微生物培养方法外，也应市场需求诞生了一些快速检测手段，如快速测试片技术、聚合酶链式反应技术、三磷酸腺苷生物发光检测技术、电阻抗技术、荧光光电法、微生物挥发性有机化合物检测技术等。传统微生物检测方法所需实验材料简单、价格便宜，但操作繁琐、耗时长，约4-7天。其它几项技术操作简单，快速高效，但成本高，且易受样品中杂质干扰，仅对微生物总数进行检测，无法辨别微生物的种属；PCR技术和LAMP技术也在化妆品检测中逐渐得到应用，但一个反应只能检测单个靶标病原菌。

发明内容

为了解决化妆品中特定病原菌传统技术检测周期长，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低的问题，设计引物与多重PCR体系组装成试剂盒，提供一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及检测方法。

本发明提供了一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液。

进一步的，所述绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特异引物包括扩增绿脓杆菌的特异引物ETA-F1和ETA-R1、扩增金黄色葡萄球菌的特异引物nuc-F1和nuc-R1、扩增大肠杆菌的特异引物LacZ-F1和LacZ-R1、用于扩增沙门氏菌的特异引物invA-F1和invA-R1。

进一步的，所述特异引物的核苷酸序列依次为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

进一步的，所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，dNTPs。

本发明还公布的一种利用所述试剂盒的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)不同剂型化妆品模拟污染样品DNA模板制备，包括：

(a)亲水性样品：将无菌的化妆水或乳液样品在钠盐培养基中混匀，添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸，

(b)疏水性样品：取唇膏或粉底液样品加入灭菌矿物油和灭菌tween80中匀浆，添加灭菌生理盐水，充分混匀加入到钠盐培养基中得混合液，取上述混合液添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸；