[发明专利]一种EMS诱导软枣猕猴桃种胚下胚轴突变的新品种培育方法

权利要求书

1.一种EMS诱导软枣猕猴桃种胚下胚轴突变的新品种培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)材料选择与预处理：取9月下旬野生软枣猕猴桃成熟果实，以清水将果实中的种子洗净，并获取留水底的成熟种子；再将成熟种子与河沙1:3拌匀，种子和河沙混合物保持相对湿度为75%，并置于温度为18-20℃、相对湿度为78%的人工气候箱内黑暗处理30天；

种胚进一步发育成熟后将种子从河沙中分离洗净，在无菌超净工作台内，将种子用75%乙醇涮洗30s后移至2-5%次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗10次，并用无菌滤纸吸干表面水分；接着用无菌手术刀和镊子剥去种皮，掰开两子叶取出种胚，再分离出下胚轴，将下胚轴分批放入不同浓度的EMS溶液中，浸泡2-6h，EMS以浓度为0.1mol·L^-1、pH＝7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.1-1.5%的EMS溶液；最后用无菌水冲下胚轴10次以备接种；

(2)下胚轴胚性愈伤组织的诱导培养：将步骤(1)中经过EMS浸泡后的下胚轴转接到胚性愈伤组织诱导培养基中，并置于光照周期7h·d^-1、光照强度800lx和温度26±2℃条件下培养55天，下胚轴完全脱分化转变成黄绿色的胚性愈伤组织，并进行胚性愈伤组织继代增殖培养；所述胚性愈伤组织诱导培养基为基本培养基附加1.75 mg·L^-1油菜素内酯和0.5mg·L^-12,4-D，以及7.0g·L^-1琼脂粉，50g·L^-1蔗糖；

(3)下胚轴胚性愈伤组织再分化培养：将步骤(2)中胚性愈伤组织切割成小块，并转接到胚性愈伤组织再分化培养基中，并置于光照周期12h·d^-1、光照强度1200lx和温度26±2℃条件下继续培养45天，胚性愈伤组织分化出具有独立性、两极性、可分离的胚状体；所述胚性愈伤组织再分化培养基为基本培养基附加1.5 mg·L^-1油菜素内酯和0.2mg·L^-1 NAA，以及7.0g·L^-1琼脂粉，30g·L^-1蔗糖；

(4)胚状体复壮生长培养：将步骤(3)中胚状体剥离后转接到胚状体复壮生长培养基中，并置于光照周期10h·d^-1、光照强度1000lx和温度26±2℃条件下进行复壮生长培养，胚状体呈两极化生长，培养至30天胚状体完全发育生长为含有根和茎叶的小植株；所述胚状体复壮生长培养基为基本培养基附加0.08mg·L^-1油菜素内酯、0.12mg·L^-1赤霉素GA₃和0.01mg·L^-1 IBA，以及7.8g·L^-1琼脂条，10g·L^-1蔗糖，并调节pH值为6.0；

(5)移栽和定植及品系确定：将步骤(4)中小植株驯化炼苗后植于营养钵中，待长至15-20cm时，定植栽培到种质园圃内，观察其生长情况，并进行分类及注标签；接着将不同突变体通过嫁接方法繁育大苗，并进行不同区域栽培；最后进行筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号；

所述基本培养基由下列物质组成：马铃薯上清液25g·L^-1；铁盐：6.95mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，9.325mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；微量元素：1.25mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，0.25mg·L^-1 ZnSO₄·7H₂O，0.095mg·L^-1 KI。

2.根据权利要求1所述的EMS诱导软枣猕猴桃种胚下胚轴突变的新品种培育方法，其特征在于：所述不同浓度的EMS溶液分别为体积百分比0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%的EMS溶液。

3.根据权利要求1所述的EMS诱导软枣猕猴桃种胚下胚轴突变的新品种培育方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为6.0。