[发明专利]一种检测绵羊ZNF280BY基因拷贝数变异的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测绵羊ZNF280BY基因拷贝数变异的方法及其应用，本发明以待测公羊全基因组DNA为模板，分别利用雄性特异性的qPCR引物对P1和P2扩增公羊ZNF280BY基因和DDX3Y基因的部分片段，其中多拷贝ZNF280BY基因作为检测基因，单拷贝DDX3Y基因作为参照基因，根据定量结果计算公羊ZNF280BY基因的拷贝数，本发明可以检测用于早期鉴定公羊繁殖力的拷贝数变异分子标记，从而通过分子标记辅助选择加快公羊育种进程。本发明方法简单、快速，便于推广应用。

技术领域

本发明属于分子遗传学检测领域，涉及一种检测绵羊Y染色体ZNF280BY基因(Zincfinger protein 280B，Y-linked)拷贝数变异的方法，该方法利用qPCR技术，以DDX3Y基因(DEAD-Box Helicase 3Y-Linked)为参照，采用校正样本的绝对定量的方法计算公羊样本ZNF280BY基因的拷贝数，从而根据检测得到的能够早期鉴定公羊繁殖力的分子标记加快公羊育种进程。

背景技术

随着人们对基因组的不断深入研究，基因组结构变异越来越受到学者们的重视。Y染色体为雄性特有的染色体，在遗传育种方面有重要作用。目前已在Y染色体上发现多种多态类型：单核苷酸多态、插入/缺失、Y染色体短串联重复序列(Short tandem repeat onthe Y chromosome，STR)和基因拷贝数变异(Copy number variation，CNV)。基因拷贝数变异主要指1Kb～5Mb的DNA片段的插入和缺失。通过结合CNVs和SNPs可以为羊种全基因组关联性分析(GWAS)选择重要经济性状的候选基因提供有力支撑，从而加快育种进程和提高遗传改良效果。

哺乳动物的性染色体是由一对常染色体进化而来，其中Y染色体是所有染色体中最小的染色体，同时它也是雄性动物特有的性染色体。Y染色体主要由两部分组成：拟常染色体区(PAR)和雄性特异区(MSY)。雄性特异区约占Y染色体的95％，其中的许多基因家族在进化过程中拷贝数大量扩增，并在睾丸组织中主要或者特异性表达。总的来说，Y染色体与雄性生殖功能密切相关。通过挖掘与雄性繁殖性状相关的候选基因对雄性家畜繁殖力的早期选择和育种工作的实施可以提供重要的理论依据。

Y染色体上基因的表达根据特异性分为2类：一类是基因在不同细胞、组织和器官中广泛表达，这些基因在X染色体都有同源基因，如DDX3Y，另一类基因则属于在睾丸中特异性表达的Y染色体基因家族，这些Y染色体基因的缺失可能会导致雄性不育，如CDY、PRY、TTY1、TTY2等基因。同时不同物种的基因表达也不尽相同，如ZNF280BY、ZNF280AY、PRAMEY等就是雄性牛科动物所特有的基因。实时定量PCR(quantitative Real-time polymerasechain reaction，qPCR)方法是检测已知基因CNV的有效技术。qPCR所使用试剂成本较低，所用仪器容易普及、操作简单快捷，可实现大样本检测，克服了测序法成本高和探针杂交法信噪比高的缺点。例如，中国专利CN109082473A公开了一种公牛ZNF280AY基因拷贝数变异的检测方法及应用，但是，其仅发现ZNF280AY基因拷贝数变异与精子发生后期的精子畸形率、密度相关，对公牛分子标记辅助选择的实际应用价值有限。

绵羊是牛科动物的一种，目前对绵羊Y染色体连锁基因的研究极少，与此同时，由于Y染色体测序困难，造成绵羊Y染色体基因序列极度匮乏，使得在分子水平对绵羊Y染色体的研究极为困难。ZNF280BY基因是牛科动物Y染色体特有的多拷贝基因。ZNF280BY也被发现在绵羊Y染色体上存在。有研究表明ZNF280BY、ZNF280AY和PRAMEY在Y染色体上形成了一个60kb的基因簇，分别对应17号染色体上的同源基因簇。ZNF280BY能够编码一种锌指蛋白。锌指蛋白是哺乳动物基因组中最庞大的家族之一，具有非常广泛的生物学作用。根据锌指蛋白的功能推测ZNF280BY基因可能起重要的转录调控作用。但截至目前，尚未发现有关羊ZNF280BY基因拷贝数变异的检测及其与基因表达、繁殖性状的关联性的报道。

发明内容