[发明专利]一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用

权利要求书

1.一种检测双链RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

待测样品中的双链RNA、taqman探针与RNA间隔探针杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果；

所述taqman探针的数量为至少两条；

所述RNA间隔探针的数量为至少两条；

所述taqman探针配对的核苷酸序列位于所述RNA间隔探针配对的核苷酸序列之间。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述taqman探针的制备方法为：

根据待测样品中双链RNA的核苷酸序列设计出配对的DNA序列，合成，并在所述DNA序列的5′端修饰荧光基团，3′端修饰荧光淬灭基团得到所述taqman探针。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA间隔探针的制备方法为：

根据待测样品中双链RNA的核苷酸序列设计出配对的RNA序列，合成得到所述RNA间隔探针。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测样品、taqman探针与RNA间隔探针混合，加热后退火，所述待测样品中的双链RNA与所述taqman探针和RNA间隔探针发生杂交，得到杂交产物；

(2)在双链特异性核酸酶的作用下对步骤(1)所述的杂交产物进行切割，所述杂交产物上的taqman探针被切割并脱落，发出荧光；

(3)taqman探针脱落后的杂交产物与体系中游离的完整的taqman探针杂交，而后再被所述双链特异性核酸酶切割，继续循环，分析被切割的taqman探针发出的荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述加热的温度为80-99℃，时间为5-15min；

步骤(2)所述双链特异性核酸酶的工作温度为55-65℃；

步骤(3)所述循环的时间为20-60min；

终止步骤(3)所述循环的方法为加入双链特异性核酸酶终止反应液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)分析操作还包括制备标准曲线；

所述标准曲线的制备方法为：

采用已知浓度的dsRNA、taqman探针与RNA间隔探针杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，并绘制浓度与荧光信号值的标准曲线。

7.根据权利要求5-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测样品、taqman探针与RNA间隔探针混合，80-99℃加热5-15min，退火，所述待测样品中的双链RNA与所述taqman探针和RNA间隔探针发生杂交，得到杂交产物；

(2)双链特异性核酸酶在55-65℃下，对步骤(1)所述的杂交产物进行切割，所述杂交产物上的taqman探针被切割并脱落，发出荧光；

(3)taqman探针脱落后的杂交产物与体系中游离的完整的taqman探针杂交，而后再被所述双链特异性核酸酶切割，继续循环，所述循环的时间为20-60min，加入双链特异性核酸酶终止反应液，分析被切割的taqman探针发出的荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。

8.一种检测双链RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用如权利要求1-7任一项所述的方法检测双链RNA，所述试剂盒中包括：taqman探针、RNA间隔探针、双链特异性核酸酶和RNA酶抑制剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含至少两条taqman探针；

所述试剂盒中包含至少两条RNA间隔探针；

所述试剂盒中还包含双链特异性核酸酶缓冲液；

所述试剂盒中还包含双链特异性核酸酶终止反应液。

10.如权利要求8或9所述的试剂盒在检测RNAi转基因作物的双链RNA含量中的应用。