[发明专利]一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用

说明书

本发明提供一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用。所述方法包括如下步骤：待测样品中的双链RNA、taqman探针与RNA间隔探针杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。所述方法操作简单，利用DSN酶的切割特性，切割杂交所得到的DNA/RNA双链，被切割之后的taqman探针从双链上脱落并发出荧光，所述RNA间隔探针能够促进RNA二级结构的展开，提高taqman探针与dsRNA的杂交效率，实现定量检测，检测范围广，能够检测1pM～50nM范围内的dsDNA。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，涉及一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用，尤其涉及一种检测RNAi转基因作物中的双链RNA的方法及其试剂盒与应用。

背景技术

DSN(Duplex-specific nuclease，双链特异性核酸酶)是一种从堪察加螃蟹(Paralithodes camtschaticus)肝胰腺中提取的一种热稳定核酸酶，能够选择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，对ssDNA或RNA几乎没有活性。由于DSN的独特的性质，在设计合成的DNA探针形成DNA-RNA杂交时，DSN非常适合于RNA的检测。近年来，荧光法、电化学法和比色法中广泛使用DSN检测RNA，且具有很高的灵敏度。

RNA干扰(RNAi)是指外源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子引起的序列特异性降解靶基因信使RNA(mRNA)，导致内源靶基因沉默的现象。RNAi首先发现于秀丽隐杆线虫中，随后逐渐成为一种有力的工具被用于新型转基因抗虫作物的培育。与传统转基因技术相比，RNAi技术应用于抗虫作物上时具有更高的特异性，效果更好。然而，RNAi技术潜在的风险包括非期望的基因沉默和对人与环境的危害也引起了人们的关注。

由于RNAi转基因作物不表达新的蛋白，所以dsRNA成了RNAi转基因作物检测的最佳候选物。然而，相比于MicroRNA(miRNA)，RNAi产生的dsRNA具有复杂的二级结构，这对于准确、灵敏地检测dsRNA是一个极大的挑战。

生物样品中dsRNA的检测方法包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Northernblots。尽管变性的Northern blots可以检测出dsRNA的种类，但是这个方法的通量很低，而且需要大量的RNA样品。RT-PCR是一个高通量的检测方法，能够扩增具有复杂二级结构、反向重复序列的dsRNA。

但是，RT-PCR扩增dsRNA也存在一些缺点，比如RNA双向表达时的自启动会干扰模板的特异性，特异性地检测dsRNA时需要修改标准的RT-PCR方法。此外，RNA样品需要纯化，以消除与基因组DNA中同源序列的杂交。同时，dsRNA复杂的二级结构常常会导致检测结果准确度较低，且灵敏度较差。

因此，开发一种准确、灵敏度高且操作简单的dsRNA检测方法，是检测RNAi转基因植物中dsRNA时亟需解决的问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测双链RNA的方法及其试剂盒与应用，即基于杂交的荧光平台并辅以DSN酶的信号放大手段，实现双链RNA的定量分析，且所述方法简单、快速、特异且灵敏度较高。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测双链RNA(dsRNA)的方法，所述方法包括如下步骤：taqman探针、RNA间隔探针(RNAspacer)与待测样品中的双链RNA杂交得到杂交产物，利用双链特异性核酸(DSN)酶进行切割，所述taqman探针从所述杂交产物上脱落并发出荧光，而后继续杂交并切割，分析荧光信号，得到所述双链RNA的检测结果。