[发明专利]确定蛋白质和肽的异构氨基酸残基的方法

说明书

本发明涉及一种用于确定肽的异构氨基酸残基的质谱法，并且包括以下步骤：使用肽的氨基酸前导序列生成候选肽的列表，所述前导序列包含确定的氨基酸残基的位置和至少一个具有未确定的异构氨基酸残基的位置；预测各候选肽的碰撞截面；将预测的各候选肽的碰撞截面与实验法确定的肽的碰撞截面进行比较，并且将最佳匹配的候选肽的异构氨基酸残基分配给肽的异构氨基酸残基。

技术领域

根据本发明的方法涉及通过质谱法区分包含异构氨基酸残基的肽和蛋白质。

背景技术

Hurtado等人的文章(Mass Spec.rev.,2012,31,609–625:“Differentiation ofisomeric amino acid residues in proteins and peptides using massspectrometry”)综述了鉴定生物大分子中的结构和空间异构体的质谱法的发展，所述生物大分子例如为天冬氨酸和异天冬氨酸(Asp/IsoAsp)、亮氨酸和异亮氨酸(Leu/Ile)、谷氨酸和g-谷氨酸以及D/L对映异构体。

Hurtado等人教导了，使用质谱法表征和区分生物大分子中的异构体是本领域科学家面临的最重要的挑战之一。高分辨率MS仪器的能力以及新的碎片化方法的发展提供了间接区分异构体的能力。这种能力使得质谱能够发展成多学科技术，结合了诸如药学研究、蛋白质组学、高分子科学和医学的领域。

Hurtado等人进一步教导，已经进行了许多尝试以区分肽中的异构体形式，例如(a)通过快原子轰击(FAB)的离子化/碎片化；(b)在500eV范围内的高碰撞能量下的碰撞活化解离(HE-CAD，也称为HE-CID)；(c)通过电子捕获解离ECD，特别是通过高电子能量的电子捕获解离(热ECD或HE-ECD)进行的碎片化；以及(d)通过电子转移解离(ETD)进行的碎片化。

Armirottiet等人的文章(Am Soc Mass Spectrom 2007,18,57–63:“How toDiscriminate Between Leucine and Isoleucine by Low Energy ESI-TRAP MSn”)教导了，在涉及单步串联质量采集的肽测序实验中，亮氨酸和异亮氨酸是不可区分的，并且提出了一种质谱方法以在连续MSⁿ实验中区分这两种氨基酸，其利用了产生诊断性69Da离子的异亮氨酸的气相碎片化。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种用于确定肽的异构氨基酸残基的方法。该方法包括以下步骤：采集肽的碎片质谱(MS²)；使用碎片质谱(fragment mass spectrum)确定肽的前导序列，所述前导序列包括确定的氨基酸残基的位置和至少一个具有未确定的异构氨基酸残基的位置；以及实验法确定在气相中的肽的离子迁移率或碰撞截面。该方法的特征在于，生成在至少一个位置具有不同异构氨基酸残基的候选肽的列表，并且将候选肽的预定或预测的离子迁移率或碰撞截面与实验法确定的肽的离子迁移率或碰撞截面进行比较，并且将最佳匹配的候选肽的异构氨基酸残基分配给肽的异构氨基酸残基。

例如，可以通过将肽的碎片质谱与文库中所保存的肽的碎片质谱进行匹配来确定肽的前导序列，其中文库中的前导序列是已知的。优选通过低能碰撞诱导解离(CID)(特别是碰撞能量低于100eV)使肽碎片化，但也可以通过诸如表面诱导解离(SID)或紫外光解离(UVPD)的其他破碎方法使肽碎片化。低能量意味着基本上没有氨基酸残基内部的内键裂解，而是氨基酸残基之间的键断裂(骨架裂解)。此外，可以从肽的碎片质谱或从肽的质谱实验法确定肽的质量，并且用于确定肽的前导序列。

在多种肽的第一实施方案中，根据离子迁移率在时间上分离多种肽，并且另外根据质量分离单一的肽并且在碎片池中使该单一的肽破碎，从而以数据依赖型采集模式采集该单一的肽的碎片质谱。在根据质量过滤之前或之后，可以根据离子迁移率在时间上分离多种肽。在采集肽的碎片质谱之前，优选根据离子迁移率在时间上分离多种肽，并且采集分离的肽的质谱以便获得多种肽的离子迁移率/质量图。