[发明专利]一种人胚胎干细胞的构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种人胚胎干细胞的构建方法。本发明提供一种人胚胎干细胞的构建方法，所述构建方法包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M‑HLA‑G1融合蛋白的多核苷酸，所述B2M‑HLA‑G1融合蛋白包括第一B2M片段和HLA‑G1片段，整合获得的人胚胎干细胞不表达游离的B2M蛋白。本发明所提供的人胚胎干细胞的构建方法构建获得的人胚胎干细胞细胞系内源性HLA‑A，B，C蛋白无法到达细胞膜表面，因此该细胞系不能被CD8⁺ T细胞识别，可以有效阻止同种异体细胞免疫排斥，且胚胎干细胞的多能性以及增殖的能力并未受到影响，依然可以作为未来细胞移植的目的细胞来源。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种人胚胎干细胞的构建方法。

背景技术

多能性干细胞具有能在体外培养环境中无限分裂增殖以及在特定诱导条件下定向分化为三胚层来源的所有细胞类型的能力，因此，在再生医学的未来发展中被给予了厚望。早在十年前，Thomson(Thomson et al.,1998)与Reubinoff(Reubinoff et al.,2000)教授等人便率先开始建立并分化人类胚胎干细胞系。在他们的研究基础上，更多的科学家开展了应用多能性干细胞作为功能性细胞来源，修复受损组织功能与治疗退行性疾病的研究。在动物模型当中，分化后的胚胎干细胞表现出了对脊髓损伤(Soundararajan et al.,2007)、糖尿病(Liu and Lee,2012)、帕金森氏病(Barberi et al.,2003)、肝衰竭(Soto-Gutierrez et al.,2006)等疾病的治疗能力。尽管有这些令人振奋的研究结果，与多能干细胞移植物相关的免疫排斥问题尚未有良好的解决方案，这已经成为了未来细胞替代疗法的最大临床应用障碍之一。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人胚胎干细胞的构建方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种人胚胎干细胞的构建方法，所述构建方法包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括第一B2M片段和HLA-G1片段，整合获得的人胚胎干细胞不表达游离的B2M蛋白。

在本发明一些实施方式中，所述HLA-G1片段包括：

a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽片段；或，

b)氨基酸序列与SEQ ID No.1具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。

在本发明一些实施方式中，所述第一B2M片段包括：

c)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽片段；或，

d)氨基酸序列与SEQ ID No.2具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。

在本发明一些实施方式中，所述B2M-HLA-G1融合蛋白还包括位于第一B2M片段和HLA-G1片段之间的第一柔性连接肽段；

和/或，所述B2M-HLA-G1融合蛋白自N端至C端依次包括第一B2M片段和HLA-G1片段，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的多肽片段。

在本发明一些实施方式中，将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸的方法具体包括：将HLA-G1片段的编码基因与人胚胎干细胞中内源性的B2M基因融合，优选为将HLA-G1片段的编码基因替换位于内源B2M基因外显子3中的终止密码子。

在本发明一些实施方式中，所述构建方法还包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G5融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G5融合蛋白包括第二B2M片段和HLA-G5片段。