[发明专利]一种二价铁荧光探针及其应用

说明书

本发明公开了一种二价铁荧光探针及其应用。本发明的二价铁荧光探针的结构式如式I所示；首次将二价铁荧光探针技术应用于功能微生物选育中，利用三价铁在细菌细胞内被还原成二价铁的显色过程结合流式细胞仪进行特异筛选功能活性细菌。本发明建立了一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物选育研究模式，可更高效、直观、特异地对单个细胞进行快速、高灵敏分析分选，能为功能微生物的高效选育提供新的工具，也能为功能微生物单细胞研究和未培养微生物的深入挖掘提供技术支撑。

技术领域

本发明属于功能微生物选育技术领域，具体涉及一种二价铁荧光探针及其应用。

背景技术

铁矿物广泛地存在于缺氧的地下环境中，可作为许多微生物的电子受体。虽然微生物的铁还原过程是地球上最古老的呼吸形式之一，但是铁还原微生物所具有的独特的电子转移方式(如细菌的纳米导线、矿物介导的种间电子转移和直接的种间/细胞间电子转移等)近年来才被发现报道。在自然环境中，具有铁还原能力的微生物引发的电子转移是硫化物、有机物氧化和许多其他生物地球化学过程的重要驱动力。例如，厌氧条件下铁的异化还原过程会强烈影响各种有机无机污染物的环境行为。在铁还原微生物的异化作用中，Fe(III)被用作电子受体，还原产生的Fe(II)，偶联多种有机无机物的氧化。异化铁还原微生物具有强大的代谢能力，铁还原菌可以影响到除Fe(III)之外的很多重金属以及放射性核素，如Mn(IV)、Cr(VI)、 Ag(I)、Au(III)、Hg(II)、V(V)、Sr(II)、Co(II)等生物的地球化学循环，在厌氧地层的生物修复中起到重要作用。这些很多重金属以及放射性核素在以高价态存在时往往会形成对环境有害的污染物，一旦被还原为低价态后或形成沉淀，或与Fe(II)形成共沉淀，使得其毒性降低。因此异化Fe(III)还原在污染环境的生物修复中表现出了很大的优势。此外，铁还原能力的微生物在废水处理、生物电化学系统(BESs)等工程过程或生物反应器中起着关键作用。因此，开展铁还原微生物的鉴定和分离及其特性研究将有助于深入了解微生物铁还原过程，不仅可以丰富污染修复的生物材料，而且为污染修复应用提供重要的理论依据。

鉴定具有铁还原能力的微生物是分离筛选铁还原微生物的前提，目前最常用的鉴定方法是Fe²⁺的分光光度法：让Fe³⁺的水溶液和微生物共培养，然后具有铁还原能力的微生物把Fe³⁺还原成Fe²⁺，然后用Fe²⁺与邻菲罗啉在pH 3.5～7下反应形成橙红色的络合物，在分光光度计下测510nm的吸光度。然而，当暴露在空气中时，橙红色的络合物的颜色并不稳定。此外，该方法不能用于从复杂的环境样本或在单个细胞水平上识别、定位或量化铁还原菌。目前，还没有方法能从原位或者混合环境中可视化鉴定铁还原微生物。荧光探针标记技术的出现为可视化原位鉴定铁还原微生物提供了技术支持。荧光探针标记技术不仅可以快速可视化鉴定混合环境中的铁还原微生物，还可以相对定量地鉴别铁还原微生物的还原能力，为现实环境样品中筛选铁还原微生物提供了有效的依据。

分离选育具有铁还原能力的微生物，是开展环境治理和修复，加速重金属污染物去除的核心工作。传统平板分离筛选方法所获得的单个细胞的性状和功能需要在单个克隆增殖后以群体的形式体现从而导致其功能表征的滞后性和低灵敏性。而以群体形式存在的微生物细胞之间的异质性又导致其功能表征的不确定性，从而降低了筛选的准确性。而且，传统筛选方法只能对在特定培养基中生长较快的功能微生物进行筛选，对于难培养或生长较慢的微生物难以实现分析筛选。因此，在单个细胞水平实现对微生物功能活性的快速、准确地分析与追踪筛选是功能微生物高效选育的关键。