[发明专利]一种PIK3CA基因突变检测方法及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种PIK3CA基因突变检测方法及其试剂盒，具体的地，本发明公开了一种检测PIK3CA基因突变的引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，能够同时检测PIK3CA基因的11种突变类型，本发明的方法和试剂盒适用于dPCR检测，可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。

技术领域

本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及一种PIK3CA基因突变检测方法及其试剂盒。

背景技术

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)位于染色体3q26.32上,长92kb，由23个外显子组成，编码IA类磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3Ks)的催化亚单位p110α，其主要功能是将4,5-PIP2催化成3,4,5-PIP3作为第二信使结合并激活多胞内靶蛋白。

PIK3CA是一个致癌基因，该基因突变时通过PI3K/AKT途径，能持续刺激下游AKT活化，使得成纤维细胞和乳腺上皮细胞持续增殖，抑制细胞凋亡，故此密切关系到肿瘤的发生和发展。

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率和死亡率逐年上升，且愈加年轻化。据研究报道，约有8-40％乳腺癌患者存在PIK3CA基因突变，是p53突变和HER-2扩增之外最为常见的乳腺癌基因突变，其主要突变热点集中在第9(E542K、E545X)、20(H1047X)号外显子上。石蜡包埋组织样本是临床肿瘤基因突变检测最常用的样本类型，该类样本的检测对检测方法的要求较低，但组织样本的获取难度较大、不能多次采样、具有创伤性，且存在严重的异质性。相比而言，血浆样本可克服取样困难、取样次数限制及异质性等问题，是理想的肿瘤基因检测样本类型。但研究表明，血浆中肿瘤游离核酸占比较低，小于1％，因此对检测技术的灵敏度要求较高。

目前PIK3CA基因突变常用的检测包括一代测序(Sanger测序)、高通量测序、荧光定量PCR等检测方法。这些方法均存在灵敏度不佳，仅能对石蜡包埋组织样本进行检测，对血浆中少量的肿瘤游离核酸检测效果较差等缺陷。

(1)一代测序技术，Sanger测序主要是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段。

从而获得DNA碱基序列。缺点是周期长，费用大，且容易发生交叉污染，灵敏度不高。

(2)高通量测序，高通量测序技术是对一代测序的一次革命性改变，其一次能对几十万，甚至几百万条DNA分子进行序列测定，具有通量高、准确度高、灵敏度高等特点，但其成本较高，不适合用于适合单基因突变检测。

(3)荧光定量PCR，是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。探针5’端标记一个荧光分子，3’端标记一个荧光淬灭分子。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)。PCR扩增时，由于Taq酶5’→3’外切酶活性，将探针水解，使荧光分子和淬灭分子间距增大，荧光监视系统检测到荧光信号。荧光PCR在检测突变基因突变时，特异性较差，检测灵敏度不佳，不适合用于血浆游离核酸的检测。

因此，本领域迫切需要开发能够有效检测血浆中PIK3CA基因突变的技术以满足临床的需求。