[发明专利]一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法

权利要求书

1.一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1配制标准工作液和质控工作溶液，分别称量25-羟维生素D2标准品和25-羟维生素D3标准品，使用甲醇溶解成标准品溶液，将两种标准品溶液混合成标准品混合液母液，所述的标准品混合液母液中两种标准品的浓度比是25-羟维生素D2：25-羟维生素D3＝1：4；用甲醇将标准品混合液母液稀释成系列浓度梯度的标准品混合液，为标准工作液；再用甲醇将标准品混合液母液稀释成质控浓度溶液，为质控工作溶液；

步骤S2全血基质准备,取抗凝全血，离心去除上层血浆，使用磷酸缓冲盐溶液对沉淀进行多次复溶清洗，按体积比例血细胞：牛血清白蛋白溶液＝55：45加入7％的牛血清白蛋白溶液，混匀备用；

步骤S3干血片标准曲线及质控样本制备，取若干份步骤S2中处理过的全血基质，分别加入系列浓度的标准工作液，配制成系列标准曲线溶液，混合均匀，再分别从系列标准曲线溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；

再取若干份步骤S2中处理过的全血基质，分别加入质控工作溶液，配制成质控溶液，混合均匀，再分别从质控溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；

步骤S4样本前处理，从步骤S3中获得的各血滤纸片中将带有血液样本的部分打出，分别置于含有内标品的甲醇中，涡旋，再使用超声波辅助萃取；干燥萃取液并加入4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮溶液，混匀后反应20-40min，加入乙醇终止反应，干燥，再加入70％甲醇复溶，得待分析样本溶液备用；

步骤S5，将步骤S4获得的各待分析样本溶液分别进行高效液相色谱-质谱分析。

2.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的标准工作液的各系列浓度和质控工作溶液的浓度如下：

6个浓度的标准工作液组成系列浓度的标准工作液。

3.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的抗凝全血是EDTA-K₂抗凝全血；所述的离心条件是3500r/min离心15min；所述的使用磷酸缓冲盐溶液对沉淀进行多次复溶清洗是加入3倍血细胞体积的1x磷酸缓冲盐溶液，混合均匀，再3500r/min离心15min，重复清洗3-5次；所述的1x磷酸缓冲盐溶液的pH7.4。

4.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的步骤S3中的系列标准曲线溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、25、50ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为2.0、4.0、10、20、100、200ng/mL；所述的步骤S3中的质控溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为1.5、10、40ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为6、40、160ng/mL。

5.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的步骤S4中的甲醇的内标品为25-羟维生素D2-d3和25-羟维生素D3-d3，浓度均为20ng/mL；所述的涡旋时间是5s；所述的超声波辅助处理时间是30min，超声波频率为40kHz；所述的干燥为使用氮气吹干。