[发明专利]一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法在审
申请号: | 202010298150.0 | 申请日: | 2020-04-16 |
公开(公告)号: | CN111474255A | 公开(公告)日: | 2020-07-31 |
发明(设计)人: | 郭士博 | 申请(专利权)人: | 上海中科新生命生物科技有限公司 |
主分类号: | G01N30/02 | 分类号: | G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72 |
代理公司: | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人: | 肖平安 |
地址: | 201109 上海*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 干血片 样本 检测 25 羟基 维生素 方法 | ||
1.一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤S1配制标准工作液和质控工作溶液,分别称量25-羟维生素D2标准品和25-羟维生素D3标准品,使用甲醇溶解成标准品溶液,将两种标准品溶液混合成标准品混合液母液,所述的标准品混合液母液中两种标准品的浓度比是25-羟维生素D2:25-羟维生素D3=1:4;用甲醇将标准品混合液母液稀释成系列浓度梯度的标准品混合液,为标准工作液;再用甲醇将标准品混合液母液稀释成质控浓度溶液,为质控工作溶液;
步骤S2全血基质准备,取抗凝全血,离心去除上层血浆,使用磷酸缓冲盐溶液对沉淀进行多次复溶清洗,按体积比例血细胞:牛血清白蛋白溶液=55:45加入7%的牛血清白蛋白溶液,混匀备用;
步骤S3干血片标准曲线及质控样本制备,取若干份步骤S2中处理过的全血基质,分别加入系列浓度的标准工作液,配制成系列标准曲线溶液,混合均匀,再分别从系列标准曲线溶液中取出血液滴于血滤纸片上,晾干待用;
再取若干份步骤S2中处理过的全血基质,分别加入质控工作溶液,配制成质控溶液,混合均匀,再分别从质控溶液中取出血液滴于血滤纸片上,晾干待用;
步骤S4样本前处理,从步骤S3中获得的各血滤纸片中将带有血液样本的部分打出,分别置于含有内标品的甲醇中,涡旋,再使用超声波辅助萃取;干燥萃取液并加入4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮溶液,混匀后反应20-40min,加入乙醇终止反应,干燥,再加入70%甲醇复溶,得待分析样本溶液备用;
步骤S5,将步骤S4获得的各待分析样本溶液分别进行高效液相色谱-质谱分析。
2.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法,其特征在于,所述的标准工作液的各系列浓度和质控工作溶液的浓度如下:
6个浓度的标准工作液组成系列浓度的标准工作液。
3.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法,其特征在于,所述的步骤S2中的抗凝全血是EDTA-K2抗凝全血;所述的离心条件是3500r/min离心15min;所述的使用磷酸缓冲盐溶液对沉淀进行多次复溶清洗是加入3倍血细胞体积的1x磷酸缓冲盐溶液,混合均匀,再3500r/min离心15min,重复清洗3-5次;所述的1x磷酸缓冲盐溶液的pH7.4。
4.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法,其特征在于,所述的步骤S3中的系列标准曲线溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、25、50ng/mL:25-羟维生素D3的浓度分别为2.0、4.0、10、20、100、200ng/mL;所述的步骤S3中的质控溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为1.5、10、40ng/mL:25-羟维生素D3的浓度分别为6、40、160ng/mL。
5.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法,其特征在于,所述的步骤S4中的甲醇的内标品为25-羟维生素D2-d3和25-羟维生素D3-d3,浓度均为20ng/mL;所述的涡旋时间是5s;所述的超声波辅助处理时间是30min,超声波频率为40kHz;所述的干燥为使用氮气吹干。
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