[发明专利]一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法

说明书

本发明提供一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其采用干血片样本结合高效液相色谱‑质谱联用分析，不仅降低了样本用量，仅需要约相当于12 L全血量的干血片样本，相对于现有技术中的分析方法，本发明提供的分析方法在分析流程、时长和灵敏度方面均具有明显优势，建立了一种样本消耗量低、准确、灵敏和快速的25羟基维生素D分析方法。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法。

背景技术

维生素D(VitaminD)为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素，它是一种脂溶性维生素，维生素D缺乏会引起佝偻病、手足抽搐、软骨病等疾病，但是长期摄入过多的维生素D，将引起血管和器官钙化。因此定期检测人体内维生素D的水平，对于衡量人体维生素D补充效果，及维持人体健康具有重要的意义。

维生素D的主要组成成分是维生素D2和D3两种化合物，两者在肝脏中代谢形成25-OHD，在肾脏中进一步代谢形成1,25(OH)2D。在血液中，维生素D的最主要存在形式为25-OHD，约占维生素D总量的95％，且半衰期最长，性质非常稳定。目前，国际上大多认为25-OHD是衡量体内可利用维生素D水平的最佳指标。

目前，检测维生素D的方法有酶联免疫法、放射免疫法、液相色谱法及液相色谱质谱法等。免疫学方法由于存在抗体交叉反应及25-OHD2和25-OHD3识别不一致的问题，检测准确性备受质疑。LCMS/MS分析技术特异性高，被认为时检测25-OHD的金标准，使用LCMS/MS同时测定25-OHD2和25-OHD3的方法已见报道，但样本用量通常较大，实践过程中常常无法获取足量样品用于检测。

发明内容

基于现有技术存在上述问题，本发明的目的是提供一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其采用干血片样本结合高效液相色谱-质谱联用分析，不仅降低了样本用量，仅需要约相当于12μL全血量的干血片样本，相对于现有技术中的分析方法，本发明提供的分析方法在分析流程、时长和灵敏度方面均具有明显优势，建立了一种样本消耗量低、准确、灵敏和快速的25羟基维生素D分析方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，包括如下步骤：

步骤S1配制标准工作液和质控工作溶液，分别称量25-羟维生素D2标准品和25-羟维生素D3标准品，使用甲醇溶解成标准品溶液，将两种标准品溶液混合成标准品混合液母液，所述的标准品混合液母液中两种标准品的浓度比是25-羟维生素D2：25-羟维生素D3＝1：4；用甲醇将标准品混合液母液稀释成系列浓度梯度的标准品混合液，为标准工作液；再用甲醇将标准品混合液母液稀释成质控浓度溶液，为质控工作溶液；

步骤S2全血基质准备,取抗凝全血，离心去除上层血浆，使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)对沉淀进行多次复溶清洗，按体积比例血细胞：牛血清白蛋白(BSA)溶液＝55：45加入7％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混匀备用；

步骤S3干血片标准曲线及质控样本制备，取若干份步骤S2中处理过的全血基质，分别加入系列浓度的标准工作液，配制成系列标准曲线溶液，混合均匀，再分别从系列标准曲线溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；

再取若干份步骤S2中处理过的全血基质，分别加入质控工作溶液，配制成质控溶液，混合均匀，再分别从质控溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；

步骤S4样本前处理，从步骤S3中获得的各血滤纸片中将带有血液样本的部分打出，分别置于含有内标品的甲醇中，涡旋，再使用超声波辅助萃取；干燥萃取液并加入4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)溶液，混匀后反应20-40min，加入乙醇终止反应，干燥，再加入70％甲醇复溶，得待分析样本溶液备用；