[发明专利]一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL及其应用

说明书

一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18520。首先合成氯羟吡啶半抗原，再制备氯羟吡啶完全抗原，免疫BALB/c小鼠，取高效价、低IC₅₀小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对氯羟吡啶具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀为0.27ng/mL）。本发明成果可用于建立鸡肉和其他含有氯羟吡啶的食品中氯羟吡啶含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术

氯羟吡啶(Clopidol，CLOP)属吡啶类化合物，是国内使用最广泛的鸡用抗球虫药之一。研究表明，在家禽养殖过程中贸然停用该类药物，往往会导致球虫病暴发，而连续或过量的用药则会造成氯羟吡啶在动物体内的残留，并会随着食物链进行蓄积和传递，而氯羟吡啶具有致畸性，会对人类健康构成极大的威胁。因此，建立有效的氯羟吡啶残留检测方法，对有效控制鸡肉产品中氯羟吡啶的残留，保障广大人民群众的身体健康，具有深远的意义。

氯羟吡啶的传统检测方法有高效液相色谱，液相色谱/串联质谱和气相色谱/串联质谱等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对氯羟吡啶的高效、快速的检测方法。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测氯羟吡啶的前提是得到对氯羟吡啶具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对氯羟吡啶具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明内容

本发明的目的是提供一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL及其应用，由该细胞株制备的抗体对氯羟吡啶具有较高的检测灵敏度，可以用来建立氯羟吡啶的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18520。

氯羟吡啶单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.18520的氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL分泌产生。

用于制备所述氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株TYL的氯羟吡啶免疫原的制备方法基本步骤为：

(1) 氯羟吡啶半抗原的制备：

称取1920 mg（10mmol）的氯羟吡啶完全溶解于25mL的0.5mol/L的NaOH溶液中，通过真空蒸馏将水除去。然后用水洗涤并用氮气吹干至室温后，将初级产物溶解于20mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，然后加入0.6 mL溴乙酸乙酯。在60℃下反应4h后，冷却至室温，再将200mL的蒸馏水加入其中，并将该混合物在4℃的冰箱中冷却过夜。再通过去离子水冲洗抽滤后，得到含有酯键的氯羟吡啶衍生物。向该产物中加入20 mL蒸馏水，然后加热至85℃。接着，再将0.5mol/L的NaOH溶液逐滴加入，直到所有的固体完全溶解。再冷却至室温后，用1mol/L的HCl溶液将pH调节至4。将反应混合物贮存于4℃过夜。最后，再通过过滤、重结晶和干燥三个步骤来获得氯羟吡啶半抗原。