[发明专利]一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法

权利要求书

1.一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）整理并比较不同物种的脯氨酰内肽酶的酶学性质，选择嗜热球杆菌（Sphaerobacter thermophiles）来源的脯氨酰内肽酶作为改造对象；

查找蛋白质数据库PDB中已解析脯氨酰内肽酶晶体结构的氨基酸序列，使用NCBI数据库的局部序列排比检索基本工具BLAST对上述脯氨酰内肽酶的氨基酸序列进行序列比对，选择与嗜热球杆菌脯氨酰内肽酶同源性最高的黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）脯氨酰内肽酶作为模版，进行同源建模，获得同源建模结构；

使用AMBER18软件进一步对上述同源建模结构进行20 ns MD模拟，取模拟过程中势能最低的结构，作为稳定的脯氨酰内肽酶结构；

2）将步骤1）得到的脯氨酰内肽酶的最低势能结构和九肽底物通过Schrödinger的Glide模块对接以生成酶-底物复合物，并对其对接结构进行20 ns MD模拟，将模拟过程中势能最低的酶-底物复合物对接结构，作为稳定的酶-底物复合物的对接结构；其中，所述九肽底物的氨基酸序列为：SEKTTMPLW；

3）对步骤2）中获得的稳定的酶-底物复合物的对接结构，通过AMBER18的leap模块对底物序列中脯氨酸P周围8 Å范围内的脯氨酰内肽酶的残基进行虚拟饱和突变，产生了若干个虚拟单点突变体，对于上述所有虚拟单点突变体进行虚拟筛选，选取具有较强结合自由能的虚拟单点突变体；

4）对步骤3）中筛选出的虚拟单点突变体，进行重组表达并纯化获得改造的脯氨酰内肽酶，采用所述九肽底物对改造的脯氨酰内肽酶进行酶催化效率的测定，挑选得到酶催化效率最高的突变体。

2.如权利要求1所述的提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其特征在于，步骤3）中所述虚拟筛选包括以下步骤：

对所有突变体进行约束动力学模拟以优化其结构，即使底物序列中Pro的C原子和所述脯氨酰内肽酶序列中Ser537的O原子之间的距离保持在在2 Å，谐波力常数为10 kcal/(mol•Å)，再使用MM/GBSA方法计算所有结构优化后的虚拟单点突变体的酶与底物的结合自由能，将结合自由能从低到高排序，尽量选择不同的原始残基并选择结合自由能较低的至少前8个突变体，留待下一步实验验证。

3.如权利要求1所述的提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其特征在于，步骤4）中所述酶催化效率的测定包括酶活的测定和酶促反应动力学参数的测定。