[发明专利]一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法

说明书

本发明改造脯氨酰内肽酶以提升其催化效率的理性设计方法主要是通过同源建模获得嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophiles)脯氨酰内肽酶，分子对接获得酶‑底物复合物结构，MD模拟使结构稳定，对底物附近的酶残基进行虚拟饱和突变，约束性MD模拟使酶处于完美催化的“近进攻态”构象，利用MM/GBSA方法计算结合自由能从而虚拟筛选出潜在催化效率提升的突变体酶。通过大肠杆菌表达系统进行酶的表达，镍柱纯化，使用HPLC测定重组酶对于九肽底物的酶活及动力学参数。结果表明，本发明分子改造设计方法可以快速有效提升脯氨酰内肽酶的催化活性，说明本发明的酶改造方法可靠。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种根据脯氨酰内肽酶的催化机制，利用一系列计算机理性计算开发一种基于催化完美构象的理性设计方法，从而定向改造提升酶的催化效率。

背景技术

蛋白质是主要营养物质之一，也是食品中的重要成分，其代谢产物在人体中具有许多必不可少的生理活性。目前，通常将外源性蛋白酶添加到蛋白质中以获得各种类型的生物活性肽，在深入了解营养、健康机制以及精确、高质量的加工技术前提下，向功能食品中添加蛋白酶的方法已得到广泛研究。但是，酶在工业生产中的应用仍然存在一些局限性，主要问题之一是蛋白酶的特异性不高，尚不能足够有效利用蛋白质原料。因此，脯氨酰内肽酶(PEPs)因为其具有对底物脯氨酸羧基端的肽键裂解具有很高的特异性而富有价值。到目前为止，已发现许多活性肽具有在C末端是脯氨酸的特征。此外，乳糜泻病患者通常不耐受具有免疫毒性的富含脯氨酸的肽，而消化道蛋白酶(胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)通常不偏好水解P1位是脯氨酸的肽。因此，脯氨酰内肽酶又可以弥补消化道蛋白酶水解的缺陷，从而最大化蛋白质食品的价值。综上，选取酶学性质优良的脯氨酰内肽酶，并在此基础上对其进行进一步理性设计改造，从而提高其催化效率，对于食品加工及医学治疗都是具有重大意义的。

脯氨酰内肽酶属于丝氨酸蛋白酶的一种，分子量大多在65-85kDa之间。脯氨酰内肽酶的结构在1998年第一次被解析出来，随后粘球菌Myxococcus xanthus(MX)和氯酚鞘氨醇单胞菌Sphingomonas capsulata(SC)两种细菌来源的脯氨酰内肽酶结构也被解析出来，其整个结构呈圆柱形，它们由两个主要结构域组成，分别为α/β水解酶折叠的催化结构域和螺旋桨结构域。催化结构域中含有包括由色氨酸、组氨酸、天冬氨酸三个氨基酸组成的催化三联体Ser-His-Asp，且催化三联体位于两个结构域界面处的大空腔中。脯氨酰内肽酶的催化机理与其他丝氨酸蛋白酶基本相同，与底物发生催化作用的主要是结合口袋中的催化三联体Ser-His-Asp，催化三联体的排布使丝氨酸处于特别活泼的状态，组氨酸可以起到碱催化色氨酸的作用，而天冬氨酸起到维持组氨酸空间构象的作用。其中脯氨酰内肽酶催化残基色氨酸上的氧原子亲核进攻底物脯氨酸上的碳原子，这一步骤是催化的重要一步。

针对蛋白质尤其是对酶的改造设计的一系列蛋白质工程学领域引起了科学家们的关注，计算机理性设计方法因为其效率高，实验筛选工作量小，可以快速获得更优突变体，而受到广泛应用。目前对于酶的计算设计主要从改造酶结合口袋的大小及其微环境(极性和电荷)出发，很少从催化机理入手。目前对于脯氨酰内肽酶的改造研究较少，且大多脯氨酰内肽酶由于催化效率、温度和pH稳定性差等因素而不适用于食品工业加工。

本发明开发了一种基于催化完美构象的脯氨酰内肽酶的分子改造理性设计方法，根据脯氨酰内肽酶的催化机制，使用催化位点Ser的O原子与底物Pro的C原子之间的距离作为标准，基于“近进攻态”构象原理，利用同源建模、分子对接、分子动力学模拟、MM/GBSA等方法虚拟筛选获得潜在催化活性提高的突变体。通过实验验证筛选突变体的酶活及动力学参数，最终获得具有更高催化活性的突变脯氨酰内肽酶。这将在食品加工和医学治疗等方面具有极其重要的价值。

发明内容