[发明专利]一种病毒纯化方法及经由该方法制备得到的二联灭活疫苗

说明书

本发明涉及一种病毒纯化方法及经由该方法制备得到的二联灭活疫苗，所述病毒纯化方法为将所述病毒的病毒液进行离心、过滤得到上清液作为待浓缩样品；将所述待浓缩样品通过100KD膜包进行浓缩，获得病毒浓缩液；将所述病毒浓缩液利用4FF凝胶层析柱进行纯化得到纯化后的病毒液。本申请通过膜包超滤浓缩纯化处理联合4FF凝胶层析对病毒液进行纯化，得到高纯度的猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒，杂蛋白去除率达到91％，有效抗原含量达到95％。将纯化后的病毒配以201佐剂制备得到的二联疫苗接种仔猪后体温波动显著降低，同时，免疫28天后抗体效价相较于纯化前分别提升69.5％和139％，有效提高安全性和免疫效果。

技术领域

本发明涉及兽用疫苗技术领域，具体涉及一种病毒纯化方法及经由该方法制备得到的二联灭活疫苗。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以水样腹泻、呕吐、食欲下降为基本特征的一种急性、高度接触性肠道传染病。各年龄阶段猪只均易感此病，尤以仔猪最为严重，其死亡率高达100％。我国在1982年首次报道PED，并在国内持续流行，直到2010年，变异毒株PEDV在国内开始流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。近年来，PED的流行更是越来越广泛，新的变异株不断出现，商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配，免疫效果不佳，从而严重影响我国养猪业的健康发展。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属，是不分节段的、单股正链RNA病毒(ssRNA)，有囊膜，其基因组全长约28.5kb。PEDV的病毒粒子具有多形性，大致呈现球形，平均直径在95-190nm之间，病毒粒子表面存在长度约18nm的花瓣状纤突，从核心向四周呈放射状分布。PEDV不耐酸碱，对乙醇和氯仿敏感，普通消毒剂可将其杀灭，耐低温不耐高温，在4℃-50℃相对稳定，在60℃以上处理30min后就会丧失感染能力。

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起猪的急性、高度接触性的消化道传染病，以呕吐、严重的腹泻、脱水为主要临床症状，并且经常同其他疾病混合发生，所有品种和年龄的猪对此病毒都易感，新生仔猪尤为严重，随着日龄的增大死亡率逐渐下降。其常与猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)以及致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli)等病原混合，是引起规模化猪场仔猪腹泻性死亡的主要原因，给我国养猪业造成了严重的经济损失。

TGEV是属于冠状病毒科、α冠状病毒属，经纯化后在电镜下观察，TGEV粒子形态多样，多呈圆形、椭圆形，直径大约90nm～200nm，表面具有双层膜结构，最外层是由双层脂质层构成的囊膜，囊膜上有8nm～24nm的花瓣样突起。TGEV在低温条件比较稳定，对热抵抗力低。

针对于PED、TGE目前尚无特效治疗药物，临床上以发病急、死亡率高、危害大为显著特征，疫苗免疫是预控该病的有效措施。目前已研制出PED和TGE的弱毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等，这些疫苗能在一定程度上降低PED和TGE所造成的严重危害，但反应特异性弱，中和抗体水平低，由于PEDV与TGEV颗粒比较脆弱，耐受力低，故迫切需要高纯度且结构完整的病毒抗原，开发新的工艺以获得高质量的病毒。疫苗安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原纯度等因素的影响。常规工艺生产的疫苗在临床应用中存在一定的副反应，主要与病毒抗原中所含的异源成分有关。这些异源成分不仅容易引起免疫副反应，造成母猪流产等问题，而且疫苗的效力会大打折扣。鉴于以细胞培养的病毒作为抗原，在临床应用上会存在一定的非特异性反应，所以，为了提高疫苗的纯净性、安全性、有效性，急需对病毒滴度和抗原纯净性做进一步提高。