[发明专利]犬细小病毒检测试剂盒

权利要求书

1.犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒检测试剂盒包括：20支PCR反应管、300μlPCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)，其中PCR反应混合物包含引物序列Primer1:F 5’-CCAACCATACCAACTCCAT-3’，R 5’-CTTGTGTAGACGCCTCAA-3’。

2.犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒检测试剂盒包括：20支PCR反应管、300μlPCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)，其中PCR反应混合物包含引物序列Primer2:F 5’-GGAGCAGTTCAACCAGAC-3’，R 5’-GCATCAACCAATGACCAAG-3’。

3.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒检测试剂盒的制备过程如下：

1)从NCBI上获得犬细小病毒序列，序列长度1755bp，序列号：AB054213.1、AB054214.1、AB054215.1、AB054220.1、AB054222.2、AB120723.1、AB120724.1、AB120726.1、AB120727.1、AB120728.1、DQ025942.1、DQ025943.1、DQ025950.1、DQ025956.1、DQ025967.1、DQ026002.1、FJ197846.1、FJ197847.1、KF149983.1、KF149984.1、KF149985.1、KJ813892.1、MH660525.1，通过ClustalX软件进行序列比对，找到突变位点；

2)使用Primer 6.0针对靶序列设计引物，挑选遵循引物设计规则且不包含突变位点的引物序列，设计的引物序列为：Primer1:F 5’-CCAACCATACCAACTCCAT-3’，R 5’-CTTGTGTAGACGCCTCAA-3’；Primer2:F 5’-GGAGCAGTTCAACCAGAC-3’，R 5’-GCATCAACCAATGACCAAG-3’，Primer1扩增长度448bp，Primer2扩增长度332bp；

3)样品处理

选择多只疑似犬细小病毒病的病死犬，采集每只病犬的的肾脏、脾脏、心脏、十二指肠、空肠、结肠、淋巴结等若干份，-20℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入2ml PBS缓冲液(pH值为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；

4)样品DNA模板提取

将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；

5)试剂盒组成

20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/ μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μlTaq酶(5U/μl)；

6)PCR扩增

取步骤四样品5μl，加入15μl PCR反应混合物、1U Taq酶，PCR反应程序：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，样品出现相应大小条带为阳性。