[发明专利]一种捕获水蛭素类多肽的探针及其应用

说明书

本发明公开了一种捕获水蛭素类多肽的生物识别探针的制备方法及应用。本发明通过在磁性固相载体表面修饰配基，间接固定凝血酶，极大程度保留其生物活性，所获得的探针可结合多种检测器实现水蛭素类多肽的提取和测定，具有选择性高、快速灵敏、稳定性好、适用性广、干扰小、重复利用率高和环境友好等优势。

技术领域

本发明属于多肽检测领域。

背景技术

水蛭素类多肽是具有与天然水蛭素相同或相似的化学结构，分子量为5～7kDa的二价直接凝血酶抑制剂，可同时作用于凝血酶的活性部位和底物识别部位。水蛭素是从水蛭唾液中分离纯化的一种由65～66个氨基酸组成的单链多肽化合物，包含HV 1，HV 2，HV 3三种变异体，是迄今最有效的凝血酶天然特异性抑制剂，类似的还有从菲牛蛭中提取的菲牛蛭素和从山蛭中分离的山蛭素。天然水蛭素产量较少，不利于临床的推广，通过基因工程技术生产的重组水蛭素，如来匹卢定、地西卢定等在临床中起到理想的疗效。研究表明，水蛭素类多肽抗凝抗栓作用强于肝素，在处理诸如心脑血管疾病、肿瘤、眼科疾病、妇科疾病、周围神经损伤等病例方面显示出巨大的优势。

现阶段，水蛭素类多肽的含量测定基本上采用生物活性法，主要有凝血酶滴定法、生色底物法、光散射法、纤维蛋白原平板法、凝血酶时间法，从药物质控模式的适用性来看，生物检测技术由于与安全性和有效性关联密切，往往比化学成分检测更具实际价值，但也有自身的缺陷：a)定量灵敏度低，当目标多肽浓度很低时，滴定法、时间法难以检出；b)定量重复性差，测定结果易受游离凝血酶活力、环境温度和底物浓度等因素的影响。c)前处理过程繁复，自动化程度不高。也有采用色谱质谱联用技术，但杂质干扰大，且无法评价水蛭素类的抗凝血活性。

免疫磁珠富集技术，是以磁珠(有时也称为“磁性微球”或“磁微粒”)作为固相载体，结合特定抗体(或抗原)，从液相环境分离目的物质的技术。磁珠可分为2部分：1)核心部分是磁性物质，如γ-Fe₂O₃、Fe₃O₄和MeFe₂O₃；2)外层由生物大分子或环氧树脂、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸或琼脂糖等大分子包裹，保证磁性的密封性良好，不易出现漏磁现象。磁珠外表还分布有特殊的活性基团，常见的活性基团有羧基或活化羧基、氨基、巯基、甲苯磺酸基和环氧基等，能通过共价或非共价方式结合抗体(或抗原)。

免疫磁珠富集技术不仅纯度高，且对样品活性几乎无损坏。目前免疫磁珠富集技术已广泛应用于特定细胞、微生物、蛋白和核酸片段的分离与检测。将其用于水蛭素类多肽的分离与检测，具有良好前景。

针对目的物质制备合适的磁珠，是达到有效富集的关键，也是难点。一般来说，制备免疫磁珠过程需要关注磁珠的大小、表面活性基团的选择、配基的选择、偶联量、封闭物、封闭方法、保存等等多个方面。有报道将凝血酶偶联到带有氨基末端的磁性微粒，从水蛭干品浸出液中分离纯化水蛭素(应用凝血酶偶联磁微粒技术对水蛭类药材中抗凝血酶活性的检测，中国医学生物技术应用杂志，2002)，但该方法存在明显的缺点：即凝血酶与氨基末端的连接是通过共价键(一般为-CO-NH-)连接，前者与水蛭素结合的位点可能被封闭或半封闭于磁性微粒的氨基末端，进而结合水蛭素的效率较低。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种捕获水蛭素类多肽效率高的探针。

本发明的技术方案如下：

一种捕获水蛭素类多肽的探针，所述探针由磁性固相载体、凝血酶配基和凝血酶组成；

其中磁珠与配基通过位于磁性固相载体表面的活性基团进行共价或非共价化学连接；

凝血酶配基与凝血酶进行非共价化学连接。

如前述的探针，所述配基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6任一所示，或在SEQ IDNO.1～6的3’或5’末端添加6～18个T碱基。