[发明专利]基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒及使用其的检测方法

权利要求书

1.一种基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：RNA抽提试剂、cDNA逆转录体系、数字PCR检测体系。

2.根据权利要求1所述的基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒，其特征在于，所述RNA抽提试剂包括如下组分：裂解液、去蛋白液、漂洗液、无RNA酶双蒸水、RNase-Free吸附柱CR3；

其中，所述裂解液的组成浓度为：50mmol/L Tris-HCl、1.0mmol/L EDTA、150mmol/LNaCl、0.1％SDS；

所述去蛋白液的组成浓度为：75％乙醇、10％tris edta、5％异丙醇、10％SDS。

3.根据权利要求1所述的基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒，其特征在于，所述cDNA逆转录体系包括如下组分：10×RT Mix、Superpure dNTPs、oligo-dT、Quant ReverseTranscriptase、RNase-Free水。

4.根据权利要求1所述的基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR检测体系按体积百分比包括如下组分：

5.根据权利要求4所述的基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物的工作浓度为20uM，终浓度为0.5uM；所述反向引物的工作浓度为20uM，终浓度为0.5uM；所述HPV检测探针的工作浓度为10uM，终浓度为0.2uM；所述Genotyping Mastermix的终浓度为1uM；所述Droplet Stabilizer的工作浓度为25uM，终浓度为1uM。

6.一种使用如权利要求1-5中任一项所述的基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)标本RNA抽提制备

(1-1)将裂解液、去蛋白液与阴道分泌物样本混匀，匀浆该混合物在15-30℃，放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

(1-2)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15sec，室温放置3min；

(1-3)4℃、12000rpm离心10min，样品分成三层：黄色的有机相、中间层和无色的水相，RNA在水相中，水相的体积约为所用裂解液试剂的50％，把水相转移到新管中；

(1-4)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中，4℃、12000rpm离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入RNase-Free吸附柱CR3中，分多次转入RNase-Free吸附柱CR3中，4℃、12000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液；

(1-5)向RNase-Free吸附柱CR3中加入500μl漂洗液，4℃、12000rpm离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中；

(1-6)将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加入30-100μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃、12000rpm离心30sec，收集洗脱液体；

(2)逆转录cDNA

(2-1)将模板RNA在冰上解冻；引物、10×RT mix解冻，解冻后迅速置于冰上；

(2-2)按照下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5min，离心后置于冰上；

组成成分	体积
10×RT Mix	2ul
Super pure dNTPs	2ul
oligo-dT	2ul
Quant Reverse Transcriptase	1ul
RNase-Free水	Xul
模板RNA	Xul
总体积	20ul

；

(2-3)37℃孵育60min；

(3)阳性质控品和阴性对照品处理

阴性对照品和阳性质控品充分混匀，10000rpm离心后使用去离子水将阴性对照品和阳性质控品分别稀释10倍，充分混匀，10000rpm离心后备用待测；

(4)将配制好的反应体系充分混匀，按32μl/管分装至1.5ml灭菌尖底离心管内，备用；

(5)加样：在步骤(4)中准备的装有混合反应液的1.5ml灭菌尖底离心管内，分别加入抽提后的标本模板8μl，或直接加入待测阴性对照品和阳性质控品各2μl，充分混匀，10000rpm离心后将1.5ml灭菌尖底离心管内混有模板的体系依次转移至source芯片的孔中；

(6)液滴生成：利用数字PCR液滴生成系统使PCR检测体系在单个反应管内生成八百万个油包水液滴；

(7)PCR扩增

循环程序设置如下：50℃2min，95℃10min；

95℃15s→60℃1min，共45个循环；

98℃10min，1个循环；

最终冷却至12℃；

保存文件，运行；

在ABI热循环仪设定PCR循环第二步温度变化截率为0.5℃/min，其他为默认值；

(8)反应完毕，存储结果以便进行数据处理；

(9)液滴荧光信号读取；

(10)结果判断：反应结束后自动保存检测数据文件，使用RainDrop Analyst softwareII对结果进行分析，选择之前质粒结果作为模板进行设门，后对VIC和FAM通道同时进行荧光补偿排除杂信号干扰。