[发明专利]基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒及使用其的检测方法

说明书

本发明提供一种基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒及使用其的检测方法，所述检测试剂盒包括如下组分：RNA抽提试剂、cDNA逆转录体系、数字PCR检测体系。其中，所述RNA抽提试剂包括如下组分：裂解液、去蛋白液、漂洗液、无RNA酶双蒸水、RNase‑Free吸附柱CR3。所述cDNA逆转录体系包括如下组分：10×RT Mix、Super pure dNTPs、oligo‑dT、Quant Reverse Transcriptase、RNase‑Free水。所述数字PCR检测体系包括如下组分：正向引物、反向引物、HPV检测探针、Genotyping Mastermix、Droplet Stabilizer、H₂O。本发明采用数字PCR技术极大减少了扩增后的背景荧光，显著提升检测通量,提升检测浓度下限，极大提高检测精确性可以做到绝对定量。

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种基于数字PCR的 HPV E6E7 mRNA检测试剂盒及使用其的检测方法。

背景技术

传统PCR由于是大体积反应系统，非特异性的扩增增加了假阳性结果和背景信号，因此，最终无法获得绝对定量的结果。数字PCR (dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的核酸定量分析技术。该技术先将核酸模板进行稀释，分配到大量独立的反应单元中，使每个反应单元中只有单个模板分子，然后进行PCR扩增反应，扩增结束后对每个反应室的荧光信号进行统计学分析，来定量 DNA拷贝数。数字PCR采用先扩增后定量，因此不依赖扩增曲线的循环阈值(Ct)，也无需采用内参基因和标准曲线，准确度高、重现性好，可以实现绝对定量分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒及使用其的检测方法，采用数字PCR技术极大减少了扩增后的背景荧光，显著提升检测通量,提升检测浓度下限，极大提高检测精确性可以做到绝对定量。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种基于数字PCR 的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒，包括如下组分：RNA抽提试剂、 cDNA逆转录体系、数字PCR检测体系。

其中，所述RNA抽提试剂包括如下组分：裂解液、去蛋白液、漂洗液、无RNA酶双蒸水、RNase-Free吸附柱CR3；

所述裂解液的组成浓度为：50mmol/L Tris-HCl、1.0mmol/L EDTA、 150mmol/LNaCl、0.1％SDS；

所述去蛋白液的组成浓度为：75％乙醇、10％tris edta、5％异丙醇、10％SDS；

所述漂洗液选用70％乙醇。

其中，所述cDNA逆转录体系包括如下组分：10×RT Mix、Super pure dNTPs(2.5mMeach)、oligo-dT、Quant Reverse Transcriptase、 RNase-Free水。

其中，所述数字PCR检测体系按体积百分比包括如下组分：

优选的，所述正向引物的工作浓度为20uM，终浓度为0.5uM；所述反向引物的工作浓度为20uM，终浓度为0.5uM；所述HPV检测探针的工作浓度为10uM，终浓度为0.2uM；所述Genotyping Mastermix的终浓度为1uM；所述Droplet Stabilizer的工作浓度为 25uM，终浓度为1uM。

其中，所述数字PCR检测体系的pH范围为8.2-8.6。

所述数字PCR检测体系为HPV不同亚型基因标准品，具体如下表所示：