[发明专利]一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种CRISPR‑Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用，主要包括可以同时靶向包括PD‑1、CTLA‑4、TIM‑3、LAG‑3在内的但不限于PD‑1、CTLA‑4、TIM‑3、LAG‑3的两种或多种免疫卡控点的串联sgRNAs（S‑sgRNAs）或对应的DNA表达载体、AsCpf1纯化蛋白等。本发明的试剂盒能够便捷、高效、特异、互不干扰的同时敲除免疫细胞中两种或更多种的免疫卡控点基因，对实现多种免疫分子联合阻断增强免疫卡控点的治疗效果提供巨大的临床实践意义，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用。

背景技术

基因编辑是在基因组水平上进行精确修饰的一种技术，可完成基因定点删除突变、基因定点插入突变、多位点同时突变和小片段的删失等。目前基因编辑技术可用于基因功能及疾病发病机理研究，生物治疗，遗传和肿瘤相关疾病的诊疗。

目前CRISPR已经成为基因编辑领域发展最快的技术，利用该技术对T细胞进行特异性改造后用于肿瘤的治疗已经取得了突破性的治疗效果。最早发现的是CRISPR/cas9系统，该系统中的蛋白质对DNA序列的识别要更加精确，减低了细胞毒性，而且CRISPR/Cas9系统的构建仅仅需要设计与靶序列互补的gRNA即可，更为简单和廉价，大大提高了基因操作的效率及简便性。然而随着研究的不断深入，CRISPR/Cas9系统也暴露了他的缺陷和局限性，如严重的脱靶效应，需要更长的sgRNA等。为此科学家们也致力于寻找新的基因编辑系统，2015年张峰小组报道了一种新型的CRISPR效应蛋白Cpf1，与Cas9相比，Cpf1的分子量小更容易进入细胞发挥作用，脱靶率低，并且Cpf1只需一段42-44个核苷酸组成的单链RNA即可识别和剪切DNA，从而简化了实验设计步骤，更有利于多基因编辑，其中AsCpf1具有更高切割效率，更低脱靶效率的优点，因此本发明试剂盒选取AsCpf1蛋白作为切割蛋白。

肿瘤免疫治疗主要包括重组抗原疫苗，CAR-T细胞，TCR-T细胞，溶瘤病毒和免疫检查点阻断等。其中免疫检查点阻断在肿瘤治疗中取得积极的疗效，该方法不直接作用于肿瘤细胞本身，而是通过解除来自肿瘤微环境对免疫细胞的抑制进而增强其对于肿瘤的识别与杀伤能力。至今已有越来越多的免疫检查点加入到免疫治治疗当中，如PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等免疫分子。目前临床应用的免疫卡控点阻断疗法只要通过抗体特异性阻断免疫卡控点，消除其免疫抑制功能，从而抑制肿瘤的生长。目前PD-1/PDL-1抗体药物已经在临床取得了良好的治疗效果，LAG-3、TIM-3等抗体药物也正在进行临床研究，即将成为下一轮抗体治疗的联合方向。

但是利用抗体药物进行靶基因的治疗还受到一些限制如:抗体的作用只是暂时阻断，并不能长久抑制；抑制性受体多种多样，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体目前还没有很好地对策；有效抗体药物研发难度大，成本高等都给抗体药物在临床应用带来了挑战。CRISPR技术快速，简便、高效特异性的敲除靶基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种可行的策略。然而现有的基因编辑还局限于对单个基因进行编辑，或多质粒共同转染用于多靶点敲除，操作复杂，编辑效率低。

发明内容

针对现有的免疫抑制分子抗体药物进行多种免疫卡控点同时阻断治疗肿瘤存在的问题，本发明提供一种CRISPR-Cpf1介导实现多个免疫卡控点基因编辑免疫细胞的试剂盒及其应用，用于多重免疫抑制分子同时阻断，可以对TIL、NK、CAR-T、TCR-T等免疫细胞进行多种免疫抑制分子阻断，增强其对于肿瘤细胞的杀伤效果。

AsCpf1与成熟crRNA形成Cpf1-crRNA核糖核蛋白二元复合体，替换CRISPR中的间隔序列可以靶定不同基因，实现多个基因的同时编辑，本发明提供一个更短更高效的xcrRNA，对多个sgRNA(其为具有核酸酶导向功能的核苷酸分子)进行串联，并与AsCpf1蛋白共同电转进入免疫细胞，同时实现多个免疫卡控点基因的高效敲除，为后续的免疫细胞技术升级奠定了基础。