[发明专利]一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，涉及生物技术领域。本发明包括利用非整合慢病毒载体系统，制备包括且不限于2019新型冠状病毒核酸序列，用于核酸检测的标准质控品的方法，用于核酸检测的标准质控品制备，通过对慢病毒辅助质粒的整合酶的64位氨基酸Asp突变成Asn，262位‑264位氨基酸Arg,Arg，Lys突变成Ala，Ala，His，构建非整合的慢病毒的方法，通过去除慢病毒的启动子等元件的方式提升病毒载体载入量，构建一种可以用于核酸检测全流程质控的假病毒，可以用于冠状病毒的假病毒构建，也可以用于SARS‑COV、MERS‑COV、流感病毒等假病毒的构建。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-NCOV)已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。冠状病毒直径约80～120NM，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有POLY(A)尾，基因组全长约27～32KB，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。

2019新冠病毒疫情爆发，疾病的最终确诊需要通过实验室的核酸检测，而实际核酸检测实验的过程比较复杂，包括病人样本的采集、病毒核酸提取、RNA反转CDNA和QPCR检测等实验环节。由于冠状病毒是烈性传染病所以整个实验中缺乏一个病毒作为全流程的阳性质控样本。以至核酸检测中常出现假阳性/假阴性问题。

慢病毒载体制备系统包括由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达GAG和POL蛋白，另一个质粒表达ENV蛋白。载体质粒与包装质粒互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

因此，利用慢病毒包装系统，构建一种可以用于核酸检测全流程质控的假病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，通过对慢病毒辅助质粒的整合酶的64位氨基酸Asp突变成Asn，262位-264位氨基酸Arg，Arg，Lys突变成Ala，Ala，His，构建非整合的慢病毒，通过去除慢病毒的启动子等元件的方式提升病毒载体载入量，用于假病毒的构建，假病毒用于核酸检测全流程质控。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，包括如下步骤：

步骤SS01：构建剔除慢病毒表达载体的非必须元件的假病毒载体；

步骤S011：将慢病毒载体在37℃水浴条件下酶切2小时；

步骤S012：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化；

步骤SS02：将2019新冠状病毒的部分基因组克隆至假病毒载体；

步骤S021：通过全基因合成的方式获得2019新冠状病毒的部分序列，合成至PUC57载体，记为PUC57-ORF 1a/bEN；合成序5’端含有PAC I酶切位点，3’端含有Nhe I酶切位点；

步骤S022：将合成完毕的ORF1 A/B，E基因和N基因通过酶切的方式获得待插入慢病毒载体的片段；

步骤S023：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化；

步骤S024：将回收的载体产物和酶切胶回产物连接；