[发明专利]一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用，所述的试剂盒包含：CHO DNA Control，DNA Dilution Buffer，2x MaxDetect qPCR Mix，10x CHO Detection Mix；本发明还涉及上述试剂盒的用途和使用方法。试剂盒中包含制备标准曲线的DNA参考品CHO DNA Control，已溯源至国家标准品，利用Taqman探针定量PCR方法，能快速、特异地检测fg水平的CHO宿主细胞的DNA残留。本试剂盒适用于生物制药的中间产物到最终成品的不同样本类型，检测结果准确可靠，精密度高，可检测浓度范围为0.3ng/μL‑3fg/μL。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用。

背景技术

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan探针法的开发

通过引入基于Taq DNA聚合酶5’-3’外切酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测，避免了普通荧光定量PCR染料会结合引物二聚体或非特异性扩增产物的假阳性。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。

TaqMan探针法的工作原理

TaqMan试剂通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。工作原理是：

1.构建一段寡核苷酸探针：5’端标记荧光染料报告基团，3’端标记淬灭染料基团。当探针保持完整时，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移(FRET)而显著降低由报告染料基团发射的荧光。

2.如果存在目标序列，探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火，并随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性，完成切除。

3.探针的切除会：

将报告染料基团和淬灭染料基团进行分离，增强报告染料基团的信号。

将探针从目的链上去除，使引物继续沿模板链末端延伸。因此，探针的介入并不会抑制整个PCR过程。

4.每经过一个循环，就会有更多的报告基团染料分子从各自的探针上切断，荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。

TaqMan探针法的优缺点

TaqMan方法的优点如下：

需要在探针和目标分子(靶点)之间发生特异性的水解(杂交)，方可生成荧光信号

可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列，无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。

使用TaqMan探针法的检测类型

用于RNA定量的一步法RT-PCR；

用于RNA定量的两步法RT-PCR；

DNA/cDNA定量；

等位基因检测；