[发明专利]基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法

权利要求书

1.一种基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法，其特征在于，包括：

以不同浓度阿莫西林给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行液质联用分析，得到代谢物的碎片信息；

通过建立正交偏最小二乘法判别分析模型对代谢物的碎片信息进行筛选，得到潜在的生物标志物；其中，筛选条件为变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1、p值小于0.05；

对潜在的生物标志物进行代谢通路富集，得到不同浓度阿莫西林引起嗜酸乳杆菌代谢紊乱发生发展的相关重要代谢通路；

将重要的代谢通路里的潜在生物标志物通过代谢通路连接起来，得到综合代谢网络；

所述液质联用分析的条件为：

采用100×2.1 mm，1.8 μm粒径，HSS T3 C18色谱柱为色谱柱；色谱柱的柱温为40 ℃；

流动相A为乙酸铵，B为乙腈，流动相流速0.3 mL•min^-1；

洗脱程序为：先用90~70% 的A液洗脱0~1.5 分钟； 然后用70-2% 的A液继续洗脱1.5~8分钟； 再用2~90% 的A液洗脱 8~9分钟；最后用90% 的A液洗脱9~10 分钟；其中，进样温度为4℃，进样量为5 μL；

采集质谱质量数范围为50~1200 Da，且所有数据在电喷雾离子源正、负离子模式下进行采集，其中，毛细管电压为3.0 kV，椎孔电压为40 kV，提取电压为4.0 kV；离子源温度为100℃，脱溶剂气温度为350℃；锥孔气流量为40 L•h^-1，脱溶剂流量800 L•h^-1；

获得所述潜在的生物标志物的具体步骤为：

根据不同浓度给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物进行分组，并设置空白对照组，分别对各组进行主成分分析、偏最小二乘法判别分析和正交偏最小二乘法判别分析；

对各组间的潜在生物标志物进行筛选，选取差异代谢物的变量重要性投影值大于1、差异倍数绝对值大于1且p值小于0.05的变量作为潜在的生物标志物；

其中，偏最小二乘法判别分析模型拟合能力指数分别为：

正离子模式下：R²X=0.554， R²Y=0.921，Q² =0.659；

负离子模式下：R²X=0.613， R²Y=0.854，Q² =0.536；

在液质联用分析之前，对嗜酸乳杆菌胞内代谢物的预处理：

把所述不同浓度给药后的嗜酸乳杆菌液分别在2000转的条件下低速低温离心10分钟，得到的沉淀；

用磷酸盐缓冲溶液对沉淀洗涤3次，之后加入3倍体积的冰甲醇提取蛋白20分钟，再经超声破碎15分钟，然后在12000转的条件下高速低温离心20分钟，取上清液；

将上清液用氮气吹干，进样前用400 μL乙腈与水等体积混合液进行复溶，并通过0.22μm尼龙滤膜过滤；

所述差异代谢物包括：甘油、胞嘧啶、烟酸、L-2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸、肌肽、乳清酸、烟尿酸、假尿嘧啶核苷、亚胺甲基谷氨酸、左旋色氨酸、尿刊酸和胸腺嘧啶。

2.如权利要求1所述的基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法，其特征在于，所述不同浓度阿莫西林给药后的嗜酸乳杆菌胞内代谢物通过以下方式获得：

取培养至对数生长期的嗜酸乳杆菌，分成4组，每组为8个生物学重复，分别给1.0×10^-4，1.0×10^-5， 1.0×10^-6 M浓度的阿莫西林，给药后24小时后收集得到。

3.如权利要求1所述的基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法，其特征在于，对潜在的生物标志物进行代谢通路富集的具体步骤为：

将潜在的生物标志物上传到MetaboAnalyst分析网页进行相关通路的富集。

4.如权利要求1所述的基于代谢组学建立阿莫西林浓度对嗜酸乳杆菌影响的方法，其特征在于，在主成分分析之前，对代谢物的碎片信息进行预处理，数据经过80%过滤原则处理，将含空白值大于 80%的变量去除；

其中，所述预处理在MarkerLynx 4.1软件和MetaboAnalyst网站进行；

所述预处理的参数为：保留时间为0~10 min；质量数为 50~1200 Da；质量数容许度为0.01；质量数窗口为 0.02；噪音去除程度为6。